[医学]Western blot法检测大鼠肝组织清蛋白的表达实验.pptVIP

核酸分子杂交 (molecular hybridization) 利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来。 在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。 探针 (Probe) 带有标记的、并已知碱基序列的DNA或RNA片段，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测是否有同源序列。 Southern 印迹杂交  （Southern Blotting) Edwin Southern 于1975年首创 Alwine于1977年建立。 用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。 Western Blotting 蛋白免疫印迹 是20世纪70年代末80年代初，在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定的基础上发展而来。 Western-blot 基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来进行检测。 Western-blot 的一般流程 蛋白样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳 转膜 免疫检测 本实验操作步骤 本实验操作步骤 考马斯亮蓝法（Bradford法） 电荷效应 各种蛋白质所带电荷不同，有效迁移率亦不同，负载电荷多的移动快，反之则慢。 分子筛效应 凝胶电泳中因凝胶浓度不同，其网的孔径大小不同，可通过的蛋白质分子量范围就不同。 大分子受阻程度大，走在后面；小分子受阻程度小，走在前面。 凝胶电泳 —— 将混合物分离 丙烯酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰胺 ? ? 3M Tris缓冲液(pH=8.8) 2M Tris缓冲液(pH=6.8) N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED) 10%过硫酸铵(APS) 10%SDS ddH2O 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗NC膜，换 水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。 三明治的制备 本实验注意事项 转膜装置： 1.缓冲液槽和盖 2.凝胶支架转印夹 3.电转印模块 4.Bio-Ice冷却装置 转膜后检测（本次实验可省略） 目的：降低膜与抗体的非特异性结合 方法：膜浸泡于封闭液（本实验采用5％脱脂 奶粉）中,于37℃轻轻摇动１h 注意事项：封闭时，膜的正面不能有气泡 封闭： 转膜及封闭操作： 准备平皿两只 去离子水 转移缓冲液 小心将胶取下，放入转移缓冲液中平衡15分钟左右 裁剪两块略小于胶的NC膜（有的NC膜需要区分正反） 浸入去离子水中摇晃5min后放入转移缓冲液中 裁剪略小于胶的厚滤纸4张，浸于转移缓冲液中 按顺序安装好转膜装置（即制备“三明治”） 低温条件下转膜，400mA恒流转膜60min左右 负极 滤纸 胶 NC膜 滤纸 正极 注意事项 1.膜和滤纸避免蛋白污染 2.胶和滤纸在转移缓冲液 中浸泡15min左右 3.上下滤纸避免接触 以防短路 4.避免气泡产生 转膜结束后，倾去转移缓冲液，拆除转膜装置 取出NC膜，并剪角以辨认正反上下 PBST洗涤5分钟 37℃条件下，5％脱脂奶粉封闭1h 加入一抗及二抗 一抗孵育 5％的脱脂奶粉稀释一抗（根据预初结果本次为1：200稀释），配制6ml 滴加一抗于塑料小盒中（一块膜大约滴3ml稀释好的一抗），将膜小心覆盖于一抗上 将小盒置于铝饭盒内，并在铝饭盒中加水少许，盖好盒盖，4℃过夜（或37℃孵育2h ） 将膜从小盒中取出，0.1M PBST洗涤4次，每次10分钟 二抗孵育 5％的脱脂奶粉稀释二抗（根据预初结果本次为1：4000稀释），配制6ml 滴加二抗于小盒中，膜小心覆盖于二抗上 将小盒置于铝饭盒内，并在铝饭盒中加水少许，盖好盒盖，37℃孵育45min 将膜从平皿中取出，0.1M PBST洗涤4次，每次10分钟 * * Western-blot 法检测大鼠肝组织清蛋白的表达 加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下复性，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。 待检测的核酸样品和同位素标记的杂交探针同时溶于杂交液中进行反应 把待检测的核酸样品先结合到某种固相支持物上，再与溶解于溶液中的杂交探针进行反应 液相杂交 固相杂交 硝酸纤维素(NC)膜，尼龙膜 利用滤纸对水的毛细管吸附作用，将经限制酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段转移到固相杂交膜上，此时的DNA片段还保留着原来凝胶中的分布图式。然后再用探针进行杂交。 Northern 印迹杂交  （Northern Blotting) Western-blot 封闭 一抗孵育 二抗孵育 底物显色（EC