免疫亲和柱技术及其在黄曲霉毒素等检测中的应用.ppt

免疫亲和柱技术及其在黄曲霉毒素等检测中的应用 免疫亲和柱 简介 原理 制备 应用范围 再生和保存 免疫亲和柱 免疫亲和柱就是利用免疫亲和层析原理制成用以分析检测抗体或抗原的亲和层析柱，免疫亲和柱技术是一种简化样品提取过程并提高样品的纯度的样品前处理技术。 1 原理 免疫亲和柱的工作原理是柱子中含有连接单克隆抗体的凝胶悬浮物，抗体对毒素有特异吸附性，待测物被柱子中免疫吸附剂上的抗体所吸附，提取液中对抗体有亲合力的目标物就被结合到 抗体上，淋洗去掉非目标分析物后采用适当条件将结合在抗体 上的目标物洗脱下来， 从而使被测物被选择性地提取与浓缩。 所得提取物可直接采用GC、HPLC、ELISA等方法进行检测。 2.1 制备抗体 食品安全检测中的目标物一般相对分子量较小，本身不具备 抗原性，但如果将其先衍生化，使其末端含有氨基、羧基、烃基 等活性基团，再通过这些活性基团与大分子物质如蛋白质基体结 合， 也能免疫产生抗体。将抗原或半抗原的基体蛋白结合物注 入实验动物体内，获得多克隆抗体。因此需要通过杂交瘤技术、 基因工程技术将抗体分离纯化制备出单克隆抗体。 2 制备 2.2 制备基体 理想基体应具有下列条件： (1)不溶于水，但高度亲水； (2)惰性物质，非特异性吸附少； (3)具有相当量化学基团可供活化； (4)理化性质稳定； (5)机械性能好，具有一定颗粒形式以保持一定流速； (6)通透性好，最好为多孔网状结构，使大分子能自由通过； (7)能抵抗微生物和醇的作用。 基体的种类 可作为固相基体的有皂土、玻璃微球、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖凝胶等。 这些基体中，各有优缺点。琼脂糖凝胶微球商品名为 Sepharrose,含糖量为2%、4%、6%时分别为2B、4B、6B；因 Sepharrose4B结构比6B疏松，吸附容量比2B大，所以应用最广。 2.3 抗体与基体偶联 基体在与抗体偶联之前，需要进行活化。一般是在基体骨架 上引入亲电基团，然后与间隔分子或抗体上的亲核基团共价结 合，需要说明的是在小配体的亲合色谱中，常在基体和配体之 间插入一个间隔臂，以减小空间位阻的影响。 常用的活化试剂包括溴化氰、环氧氯丙烷和维生素H酰肼等 抗体与活化基体的偶联方式有随机偶联与定向偶联两种。 免疫亲和柱技术及其在黄曲霉毒素检测中的应用 黄曲霉毒素 黄曲霉毒素 黄曲霉毒素(Aflatoxin，A)是黄曲霉和寄生曲霉所产生的一组结构类似的有毒代谢产物，其基本结掏为二呋喃环和香豆素。现已分离出 AFB 1 ，AFB 2 ， AFG 1 ， AFG 2 ， AFB 2a ， AFG 2a ， AFM 1， AFM 2，AFP 1 等 18 种之多，其中以 AFB 1 的毒性和致癌性最强。现已证实有17种衍生物．其中最重要的包括 B1、B1、 G1、G2、M1等5种，被WHO划为ⅠA类致癌物。黄曲霉污染范围：玉米、谷物、花生、粮食饲料、植物油、辣椒等作物。 免疫亲和柱技术在黄曲霉毒素中的应用 检测标准：我 国 对 食 品 中 的AFB 1 的限量标准 （GB 2761- 2005） 是：花生、玉米、花生油及其制品的 AFB 1 ≤20 μg/kg；大米及其他食用油的 AFB 1 ≤10μg/kg；粮食、豆类、发酵食品的 AFB 1 ≤5 μg/kg；婴儿代乳品不得检出。我国也规定牛乳中黄曲霉毒紊M1含量不得超过 0 5μg／Kg。 AFB1检测常采用酶联免疫法（ELISA），HPLC法和荧光光 度法等。ELISA方法检测成本较低，但存在较大的假阳性率,一 般作为准确定量检测前的预筛选方法。 AFM1的测定方法有薄层色谱法和高效液相色谱法，免疫亲 和柱—荧光法等。样品前处理过程繁琐、净化效果差、所需时 间长等。免疫亲和柱—HPLC，选择性高、净化效果好、检测限 低、操作简单、快速等特点．可用于牛乳中AFM1的测定。 部分黄曲霉毒素的检测方法 AFM1的检测国家新标准GB5413.37—2010中对乳和乳制品中AFM1的检测方法有“免疫亲和层析净化液相色谱—串联质谱法”、“免疫亲和层析净化高效液相谱”、“免疫亲和层析净化荧光分光法”、“双流向酶联免疫法”等4种。 样品处理简单、操作简便易行 快速准确、灵敏度高、检测限低 检测成本低廉，适合大批量检测 能避免氯仿等有毒试剂的使用，在国际上不少试验室已得到确认，也是得到AOAC的官方认可的检验方法。