第二章 细胞破碎技术.ppt

（3）蛋白质复性机制 蛋白质结构可以看作为亲水／疏水作用之间的平衡 一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及两种疏水相互作用，一是分子内的疏水相互作用，二是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用。前者促使蛋白质正确折叠，后者导致蛋白质聚集而无活性，两者互相竞争，影响蛋白质复性收率 一种假设认为肽链中的一些构象单元首先形成 一螺旋、B一折叠、 转角 等二级结构．然后二级结构之问进行组合，最后排列成三级结构 ．这足 一种从低级结构向高级结构逐步演化的“完美 假设。 另一种假设队为蛋白质的折叠首先是肽链内部疏水基团的识别并产生一个 塌陷过程．然后经过悯整形成不同层次的结构．最终折叠为活性构象。 具有一定二级结构的松散肽链折叠成活性蛋白质并不是一步完成的， 而是经历了伸展态或不完全伸展态、熔球态等各种结构的中间态到天然态 的转变。 ③层析复性 层析复性是将层析技术应用于蛋白质复性和纯化,使变性蛋白质在层析柱上重折叠为正确的空间构象,在洗脱的同时实现部分纯化。 吸附型层析复性 基本复性原理是柱平衡后,将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上,然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白,最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来,在洗脱过程中完成复性。 1.离子交换层析复性( IEC) 2.疏水相互作用层析复性( HIC) 3.亲和层析复性（AFC） 4.扩张床吸附复性( EBA) （5）蛋白质复性条件 蛋白质的复性对环境中的理化条件有很高的要求，复性时必须对温度、pH、离子强度等进行严格的限制，同时蛋白质本身的性状也对复性效率产生影响。 强酸强碱均不利于蛋白质复性，偏碱(pH8.6—8.8)、低温(4℃)情况下蛋白质复性较好。 蛋白质浓度对复性也有影响，浓度越低，聚集越不易发生 。 总而言之, 蛋白复性的关键在于： 减少分子间相互作用； 防止折叠中间体聚合； 避免形成错配的二硫键。 (6)蛋白质复性展望 由于不同蛋白质有不同分子大小、结构形式和等电点，因此，很难找到一种方法是适用于所有蛋白质复性的。但蛋白质组成的基本成分是氨基酸，空间结构有一定的规律可寻，各种蛋白质对外界物理或化学条件的反应，蛋白质内部化学键的构键要求又都有相似性，因此各种蛋白质的复性方法可以彼此借鉴。但对于某一种特定蛋白质来说，其最佳复性方法，需要在实验中进一步探索得到。 1、DNA重组技术 一个典型的DNA重组包括五个步骤： 　　 （1）目的基因的获取 　　 a.反向转录法 b.从细胞基因组直接分离法 c.人工合成法 　　 　 体外重组是把载体与目的基因进行连接。 例如，以质粒作为载体时，首先要选择出合适的限制性内切酶，对目的基因和载体进行切割，再以DNA连接酶使切口两端的脱氧核苷酸连接，于是目的基因被镶嵌进质粒DNA，重组形成了一个新的环状DNA分子（杂种DNA分子）。 　 （2）DNA分子的体外重组 　 把目的基因装在载体上后，就需要把它引入到受体细胞中。 导入的方式有多种，主要包括转化、转导、显微注射、微粒轰击和电击穿孔等方式。转化和转导主要适用于细菌一类的原核生物细胞和酵母这样的低等真核生物细胞，其他方式主要应用于高等动植物的细胞。 　　 （3）DNA重组体的导入 　 　由于DNA重组体的转化成功率不是太高，因而，需要在众多的细胞中把成功转入DNA重组体的细胞挑选出来。应事先找到特定的标志，证明导入是否成功。 　　 例如，我们常用抗生素来证明证明导入的成功。 （4）受体细胞的筛选 　 　　 　目的基因在成功导入受体细胞后，它所携带的遗传信息必须要通过 合成新的蛋白质才能表现出来。 （5）基因表达 　 目前已经成功的利用大肠杆菌发酵生产胰岛素、人的生长激素、干扰素、乙型肝炎病毒抗原、口蹄疫病毒抗原等。 （1）概念： 指蛋白质分子本身与其周围的杂蛋白质和核酸等形成不溶性的、 无活性的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白质。 2、包含体 包含体 从包含体中分离出具有生物活性的产物，通常的处理步骤为： 收集菌体细胞 细胞破碎 离心分离 包含体的洗涤 目标蛋白质的变性溶解 目标蛋白质的复性 ①重组蛋白质的表达率过高，超过了细菌的正常代谢，由于细菌的蛋白质水 解能 力达到饱和，导致重组蛋白质在细胞内沉淀下来。 ②合成速率太过，导致没有足够时间进行肽链折叠，二硫键不能正确配对。 ③与重组蛋白质的氨基酸组成有关，一般来说含硫氨基酸越高越易形成包含 体。 ④重组蛋白质是宿主菌的异源蛋白质，大量生成后，缺乏后修饰所需酶类和 辅助因子，导致中间体大量积累而沉淀。 （2）包