人教版高中生物选修（一） 5.3《血红蛋白的提取和分离》 课件 (共51张PPT).ppt

①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75） ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 C、洗涤：用300ml缓冲液充分洗涤12h 注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在。因为空隙或气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 凝胶色谱柱的装填 装配好的凝胶柱 ①加样前 打开下端出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口 样品的加入与洗脱 注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面2、贴壁加样 3、使吸管管口沿管壁环绕移动 ②加透析样品 样品渗入凝胶床 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱和收集 小心加入物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 血红蛋白 含量 组成元素 分子质量 基本单位 氨基酸连接方式 细胞中含量最多的有机物 C、H、O、N等 高分子化合物，分子量很大 R H C COOH NH2 氨基酸 结构通式： 种类：20种 脱水缩合 一个氨基酸的氨基（—NH2）和另一个氨基酸的羧基（—COOH）相结合，同时脱去一分子H20 CO NH 氨基酸 肽链 蛋白质 脱水缩合 盘曲折叠 （一条或者多条） 钛键 分子结构 NH CO 蛋白质结构的多样性 ①氨基酸的种类不同；②数目成百上千； ③排列顺序变化多端；④多肽链的空间结构千差万别 蛋白质功能的多样性 运输、调节、免疫、催化等，生命活动的承担着 学习目标 主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理 课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 课题难点： ①样品的处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理  知识点2．基础知识 基本思路 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 基本原理 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质 凝胶实际上是一些微小的多孔球体。如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等 凝胶色谱法 概念： 凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又称分子筛层析 凝胶： —血红蛋白的分离方法 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较小 相对分子质量较大 凝胶内部的通道 容易进入 无法进入凝胶内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较长 移动速度较慢 路程较短 移动速度较快 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 原理： 凝胶色谱分离蛋白质的具体过程 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 —血红蛋白的分离（鉴定）方法 电泳 概念： 原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离 依据：电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 类型： 聚丙烯酰胺 琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物等，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸 丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下发生交联共聚反应形成 蛋白质在琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素 SDS（十二烷基硫酸钠）能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差