蛋白质工程幻灯片.ppt

改良饲用植酸酶的最适PH 要使植酸酶能在畜禽体内产生有效的催化作用，就必须使酶与畜禽的生理条件(体温及消化道的pH值)相适应。 不同的动物消化道的pH值不同，即使是一种动物在消化道的不同部位pH值也不同，一般的pH值胃为1.5-3.5，小肠为5-7、大肠为7左右。因此要求饲用酶对pH值有较大的适应范围。 pH值主要影响酶活性部位上关键残基的侧链基团或底物的解离，使酶与底物不能结合，或结合后不能进一步反应生成产物。 可通过对氨基酸残基的置换，改变活性中心的氢键网，或改变氨基酸残基的电子环境。从而改变催化基团的pKa值（酸度系数）。 通过定点突变改变真菌和同序植酸酶的pH活性范围，用Lys、His替换野生的A.fumigatus (烟曲霉菌 )植酸酶Gly277、Tyr282，将产生第2个最适pH在2.8-3.4。 在同序植酸酶和A.fumigatus中K68A单点突变，以及在植酸酶进行S140Y，D14lG双突变，以植酸为底物将降低最适声值0.5-1.0单位，而酶的比活力没有明显变化。 葡萄糖异构酶（GI），又称D-木糖异构酶，属微生物酶类。1957年最早在嗜水假单胞菌中发现其活性，后来又发现近百种细菌和放线菌能合成该酶，其中绝大多数为胞内酶，只有极少数菌株能分泌胞外酶。葡萄糖异构酶能将D-葡萄糖、D-木糖和D-核糖等催化为相应的酮糖。在体外一定条件下，它也能催化D-葡萄糖转化为果糖，因而成为工业上制备高果糖浆（HFCS）的关键酶；它还可用于含木聚糖类物质发酵生产乙醇，是一种具有重大经济价值的工业用酶。 葡萄糖异构酶（EC5.3.1.5） （一）葡萄糖异构酶的基本性质 葡萄糖异构酶能催化D-葡萄糖异构化生成D-果糖，也可将木聚糖异构化为木酮糖，此外还能以D-核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖及葡萄糖3、5、6碳的修饰衍生物为催化底物，但是它只能催化D-葡萄糖或D-木糖的α-旋光异构体，而不能催化β-旋光异构体。 葡萄糖异构酶的最适温度一般在70-80℃，最适pH7.0-9.0，微偏碱性，不同种属来源的酶有一定的差别。葡萄糖异构酶的最适温度、最适pH值及稳定性还受到缓冲液种类、底物浓度、激活剂、稳定剂及反应时间的影响。另外二价金属离子对酶活力、稳定性及酶的专一性都有影响。 （二）葡萄糖异构酶的蛋白质工程 直接发酵生产的GI应用在工业生产中，已经取得了令人瞩目的成功，但仍存在一定局限性，如最适pH值为碱性、高温下稳定性还有待提高等。偏碱性条件下糖不稳定易焦化，使总产率下降；高温条件有利于反应进程的加快和平衡点的向果糖方向移动，因此对GI进行定向改造成为客观迫切的需求，而蛋白质工程技术，可在研究GI结构－功能关系的基础上，通过对某些氨基酸的替代和修饰，改变GI的结构性质，改善其工业应用性能。 表6-1 SM1033葡萄糖异构酶定点突变及其性质 突 变 性 质 K253R 热稳定性小于野生型，比活是野生型1.5倍 N184V 比活和热稳定性远低于野生型 N184D 最适pH值下降了1个单位，pI下降了0.6个单位，酶活为野生型的38.27% A198C 最适温度升高8℃，酶活为野生型的86.95% Q20L 最适反应温度下降5℃，热稳定性为野生型的78%，对底物亲和性增强 G247D 酶活提高33%，最适pH值下降0.6个单位，热稳定性降低 G138P 热稳定性比野生型提高一倍，最适温度提高10-12℃，比活与野生型相当 G138P/ G247D 酶活比野生型提高45%，80℃时比G138P更稳定 通过分析比较已知的其他种属GI氨基酸序列发现，除高温嗜热菌外，该同源位置氨基酸均为Gly（甘氨酸），而嗜热高温菌同源性部位则为Pro（脯氨酸），恰恰是它的热稳定性和最适反应温度都是最高。Pro较小的转动自由度以及刚性的吡咯烷环使得β-转角或无规卷曲结构更加稳定，从而稳定整个蛋白质的空间结构，提高蛋白质的热稳定性。这一现象在其他多种酶中都能发现，如1,6-寡葡糖苷酶、Trp合成酶、鸡腺苷酸激酶等。在蛋白质工程中，用Pro替代其他氨基酸（X-aa→Pro）也有许多应用，如T4噬菌体溶菌酶、丝氨酸蛋白水解酶、中性蛋白酶等。 葡萄糖异构酶的定点突变蛋白质工程对酶的专一性也有影响，表6-2列出了一些突变体酶对葡萄糖和木糖的催化常数。由表中可见野生型的GI对木糖的催化作用比对葡萄糖大，不同的突变酶其酶的选择性不同，双突变W139F／V186T和W139F／V186S的酶底物专一性均有利于葡萄糖的异构化反应。 表6-2 定点突变对GI底物专一性的影响 突变酶 Kcat/Km(min-1nM-1) 葡萄糖 木糖