荧光定量PCR检测Taq酶活性.pptVIP

荧光定量PCR检测TAQ酶活性 新海生物科技有限公司 邢亚东 荧光定量PCR原理 原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 荧光定量PCR原理 一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值 荧光阈值和CT 值 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。 Taq热稳定性及最适延伸温度 Taq聚合酶在97.5°C时的半衰期为9分钟。它的最适温度为75-80°C，72°C时能在10秒内复制一段1000bp的DNA片段。这种较高的酶活性有明显的温度依赖性。低温下，TaqDNA聚合酶表现活性明显降低，90°C以上时合成DNA的能力有限。 荧光定量检测 本公司荧光定量检测采用的方法是嵌合荧光染料法（SYBR GreenⅠ） SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。 SYBR Green I 检测模式 SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的染料，实验时可以实时监测反应体系中的SYBR Green I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量（双链DNA）的目的。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。 SYBR Green I的优点：SYBR Green I的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的探针，通用性较好，价格也较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。 SYBR Green I 检测模式 通过PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。 SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合後， 荧光大大增强。因此， SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。 实验方案 用不同浓度的质粒标准品建立实时荧光定量PCR标准曲线并检测该方法的灵敏性和重复性。然后在相同体系再将TAQ酶热启动后在不同温度下进行定时测试其反应扩增量及其灵明度 实验方案 1.1引物和探针的设计和合成 1.2利用引物合成软件评价无误后进行合成。 1.3引物设计要遵循引物设计原则 实验方案 2.1 目的基因荧光定量PCR标准品质粒的构建 方法：①常规PCR 以及产物胶回收②PCR 产物的克隆：TaqDNA聚合酶在扩增产物3′末端会加上A，其可与T载体配对，即TA克隆。将回收片段与载体按摩尔比5：1的比例在DNA连接酶作用下连接，构建扩增产物的重组质粒。将重组质粒转化入相应的感受态细菌中，在对应的LB 平板上进行筛选，经定性PCR初步鉴定后，提取质粒后进行测序分析。 实验方案 3.1 SYBR Green I荧光定量PCR检测目的基因反应条件的优化 依据曲线的扩增效率、线性和重复性等对荧光定量PCR反应的条件进行摸索。①PCR反应参数的优化：两步法或三步法的确定，两步法即是省略普通PCR中的延伸步骤，而将