血清清、球蛋白分离培训材料.pptVIP

* 生物化学与分子生物学实验教学中心 * 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 2 内 容 实验目的 1 实验原理 2 实验材料 3 实验过程 4 5 注意事项 3 实验目的 1.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5.了解柱层析技术 4 实验原理 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。 5 蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法 蛋白质的理化性质 常用的纯化方法 分子质量 透析、超滤 凝胶层析★ 离心 溶解度 调整pH 调整离子强度★ 降低介电常数 电荷 电泳★ 等电聚焦 离子交换层析★ 特异结合部位 亲和层析 其他性质 吸附层析 液相层析 气相层析 6 球 蛋 白 ?1 ?2 ? ? 等电点 相对分子量（×104） 含量（％） 4.88 6.9 57~67 5.06 20 2~5 5.06 30 4~9 5.12 9~15 6.2~12 6.85~7.3 15.6~30 12~20 血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量 清蛋白 A 7 1. 粗提（盐析法） 由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。 调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。 血清清蛋白 球蛋白 半饱和硫酸铵 清蛋白不沉淀，上清 球蛋白沉淀，蒸馏水溶解 10 凝胶层析分离化合物示意图 11 3.纯化（离子交换层析） 离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离 R-SO3-H+ + Pr+ R-SO3-Pr+ + H+ 阳离子交换 阴离子交换 R-N+R3OH- + Pr - R-N+R3Pr - + OH- 12 0.06mol/LNH4AcpH6.5 DEAE带正电荷 清蛋白pI 4.9，带负电荷多 a、b球蛋白pI 5.0～5.2， 带负电荷少 a、b球蛋白被洗脱,清蛋白仍被吸附 0.02mol/LNH4AcpH6.5 DEAE带正电荷 清蛋白及a、b球蛋白的pI＜6.5 ，带负电荷 g–球蛋白pI ＞6.5， 带正电荷 清蛋白及a、b球蛋白被层析柱吸附, g-球蛋白被洗脱 0.3mol/LNH4Ac pH6.5 DEAE带正电荷 缓冲液离子强度增加 清蛋白被洗脱 13 14 4.纯度鉴定（电泳） 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果 15 三、实验材料 健康人血清 葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱 饱和硫酸铵溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl2溶液 电泳仪、电泳槽 16 四、实验过程 盐析法进行粗分离 DEAE纤维素离子交换层析 粗提 脱盐 纯化 醋酸纤维素薄膜电泳 鉴定 葡聚糖凝胶层析 17 用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, 取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min 沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解 上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白）约0.8ml 用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, 凝 胶 柱 层 析 除 盐 继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约2ml 磺基水杨酸检测蛋白质 收集含有蛋白质的峰液12d 此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性 继续用0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤约2ml BaCl2检测SO42-阴性 用2~3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡 过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm） 过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm） 继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约2ml 磺基水杨酸检测蛋白质 收集含有蛋白质的峰液12d 此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性 继续用0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤约2ml BaCl2检测SO42-阴性 用2~3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡 盐析 操作流程 离子交换柱层析纯化 加样 加样 18 用1ml 0.0６mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, 离 子 交 换 柱 层 纯 化 除盐后收集的清蛋白 用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁