DNA提取完美课件.ppt

全血基因组DNA快速提取 试剂盒 （离心柱型） DNA提取的目的 基因组DNA的制备是基因分析的前提 构建文库；PCR；Southern Blots； RFLP；PFGE 荧光定量PCR；CGH DNA测序；DNA克隆等 掌握基因组DNA提取的基本方法 DNA提取的原理 独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。 器材与试剂 无水乙醇、灭菌水、恒温水浴箱、1.5ml离心管、常温高速离心机、冰箱、离心管架、移液器、吸头等。 DNA提取的步骤 破碎细胞 提 取 纯 化 操作步骤（以200μl 全血提取举例） 操作前处理： 1、第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇! 2、此试剂盒中蛋白酶K为冻干粉状，应予以短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解（浓度为20mg/ml），溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存，-20℃保存。 3、开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。 样本前处理： 1.、冻存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴迅速溶解。 2.、抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。 3、 为了最佳效果，最好使用新鲜血液标本或者 4℃存放少于 3 天 的标本，不要使用反复冻融超过3次的标本，否则会严重降低产量。 1、200ul样本放入1.5ml离心管 2、20μl 蛋白酶K溶液，室温15 分钟（期间颠倒混匀几次） 3、200μl 结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，70℃放置10分钟 如果全血起始量小于200μl，则用缓冲液BB补足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之间，则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μl-1毫升之间，则需要先进行红细胞裂解操作。 100μl异丙醇（陈旧血加200μl异丙醇），剧烈颠倒轻摇 上述各操作步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，但不可用手剧烈振荡，以免剪切DNA。 清亮 沉淀 续上 上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱Ⅵ中（吸附柱放入收集管中），10,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 吸附柱Ⅵ 1、500μ l 抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。 核酸吸附 漂洗去杂 将吸附柱Ⅵ放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。 接下 2、加入700μl 漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm离心30秒，弃掉废液。 3、加入500μl 漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。 续上 取出吸附柱Ⅵ，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热）， 室温放置3-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟。 将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟。 洗脱DNA （洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量） DNA 可以存放在2-8℃,如果要长时间存放，可以放置在-20℃ DNA保存 1、DNA在储存前要确保纯化得到的核酸的纯度。 2、纯化得到的基因组DNA最好溶解在 Tris缓冲液（pH8.0)里，因为大片段的 基因组DNA在酸性水溶液中不稳定，易水解。 DNA检测方法 纯度（OD260/OD280） 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数） OD260/OD280 1.7 说明有蛋白的污染 OD260/OD280 ＝1.7～1.9 说明纯度很好 OD260/OD280 1.9 说明有部分降解或有RNA污染 得率 紫外分光光度计进行测量 Yield＝ OD260×50ng/μ L×稀释倍数（双链DNA）