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基因克隆 目的基因的分离和制备 PCR Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应 PCR的最早设想 ： 1971年，Korana最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因”。 PCR的实现：1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis等人发明了PCR，又称为基因的体外扩增法。 1985年公开报道 PCR 1987年PCR得到美国的专利权 1989年PCR技术被“Science”杂志评为十大科技新闻之一 1993年Mullis因发明了PCR而获得诺贝尔化学奖 第一节 PCR技术的基本原理 一、PCR技术的基本原理 二、PCR扩增过程 三、PCR技术的特点 一、 PCR技术的基本原理 依据体内DNA的半保留复制机理及DNA分子在不同温度下双链和单链可以相互转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成两条单链DNA，单链DNA用4种dNTPs在引物和DNA pol的作用下合成新生的DNA互补链。 二、PCR扩增过程 1、高温变性 在高温条件下，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA变成单链DNA 变性温度： 94-97℃，常95 ℃ 30-50s，常30s 2、低温退火 当温度降低时，由于模板分子的结构较引物复杂，且反应体系中引物的量大大多于模板DNA，使引物与其互补的模板在局部形成杂交链。 退火温度： 25-60℃，常55℃ 60-90s，常60s 3、适温延伸 在DNA pol和4种dNTPs底物及Mg2+存在的条件下，pol催化以引物位起点的DNA链的延伸反应 延伸温度： 70-74℃，常72℃ 60-120s PCR原理 三、PCR技术的特点 高度的敏感性 高度的特异性 操作简便、快速 适用样品的广泛性 高度的敏感性 可将极微量（pg级）DNA扩增到紫外光下可见的水平（μg级） 从100万个细胞中检出一个靶细胞； 在细菌学中最小检出率为3个细菌 对单拷贝基因、单根头发、一滴血等微量标本进行分析 高度的特异性 PCR反应的特异性决定因素为： 引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 操作简便快速 PCR仪 1-2小时或数小时 扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广 PCR仪生产厂家 中国科学院遗传研究所 复旦大学 北京市应用新技术研究所 美国Perkin Elmer公司的TC1、480、9600 瑞典Pharmacia公司的Gene ATAGTM PCR 德国Eppendorf公司 MJ BioRad PCR仪种类 机械手臂式（转移式）PCR 变温式（固定式）PCR PCR仪 半导体式全自动PCR仪 适用样品的广泛性 对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 可以DNA或RNA，纯化的或粗制的；新鲜组织或陈旧样品；细胞或体液；完整大分子或部分降解的DNA 第二节 PCR反应体系中的各组分分析 一、引物 二、DNA pol 三、DNA模板 四、dNTPs 五、PCR反应的缓冲液 六、Mg2+ 七、 PCR反应条件的选择 八、标准的PCR反应体系 九、PCR扩增产物的分析 一、引物 引物的设计决定PCR反应的成败 PCR的效率和特异性取决于： 1、引物与模板的特异结合 2、聚合酶对引物的有效延伸 引物设计原则 1、引物长度以16-30为宜 引物过短，特异性降低 引物过长，成本增加，PCR的最适延伸温度会超过Taq DNA pol的最适温度 若引物长8bp，则平均每隔48=65536bp就有一个结合位点。人大约有43000个可能的结合位点 若引物长16bp，则平均每隔416=4.29×109bp有一个结合位点。 引物设计原则 2、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段 3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 4、碱基分布的随机性：ATGC随机分布，避免5个以上的相同碱基成串排列。尤其是引物的3‘端，不应有连续3个G或C 5、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物设计原则 6、两引物之间不互补，一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体 7、引物3‘端是引发延伸的点，不应错配：由于ATGC引起错配有一定规律，以引物3’端A影响最大，因此，3‘端的末位碱基最好选TCG，而不选A。 8、引物的特异性：引