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PCR技术在血液筛查中的应用 上海浩源生物科技有限公司 黄道培 第一部分用于血筛的NAT方法简介 PCR和TMA技术在国内市场的前景 其它NAT技术 血筛用PCR技术的特点 1.?????? 高敏感 2.?????? 高通量 3.?????? 自动化 PCR 技术应用于临检和血筛中的不同 Pool系数和灵敏度的关系原血浆（1000IU/ml）为例 PCR的基本公式和内对照的原理 加入内对照系统会降低灵敏度吗？ PCR Average Efficiency (AE) 血筛PCR中的几大技术矛盾 1.?样品制备 样品起始量越大，灵敏度越高 样品起始量越大，通量越小 2.?“假阳性”、“假阴性”和cut off值的关系 灵敏度越高出现“假阳性”的机率也越高，设置适当的Cut off值能减少“假阳性” “假阴性”和cut off值的关系：灵敏度越高出现“假阴性”的机率也越低，设置适当的Cut off值能减少“假阴性” 3.??内对照系统排除假阴性和内对照分子的竞争性抑制之间的矛盾 应提倡使用“非竞争性”的内对照系统。 4.超灵敏的PCR（即高效率）需要的各种条件较高优越反应条件的代价也较高 (1+x)n=AF ，109 PCR产物分子 5.??自动化程度越高越好。 自动化程度越高费用也越高 国产试剂必需考虑、平衡上述因素走出自己的路来既要适合国情又要保持高技术水准 第二部分 COBAS Ampliscreen的原理、质控和通量 COBAS Amplipre/ Taqman系统 防污染 第三部分适应我国血站使用的PCR技术及国产试剂 经典法(FDA批准并用于发达国家) FDA尚未完全批准而正在发展中的技术 普通荧光PCR的结果 富集式荧光PCR的结果 第四部分核酸样品制备对血筛的重要性 血站核酸样品(RNA和DNA)的制备 样品制备主要方法 以磁性微粒为载体提取核酸 以膜吸附和过滤为基础提取核酸 膜的类型：凝胶或者硅膜等 凝胶面积（理论值）： 膜直径：0.7～1.5厘米 S＝0.8～3.5平方厘米 缺点：可利用吸附面积小，承载量有限 第五部分几种设备的介绍 几种样品制备的设备 AGOWA? Maxisep 2400 and MultiPROBE IIEX Tecan Freedom EVO连续样品制备系统 Roche MagNA Pure LC全自动核酸分离纯化分装系统 几种PCR扩增仪及分析系统 Roche COBAS Amplicor Roche COBAS Taqman Eppendorf epMotion5075PCR体系移动工作站 全自动（油封）加样仪 eGene HDA-GT12高通量微流芯片检测系统 Caliper LabChip 90高通量微流芯片检测系统 End 方法和试剂全部开放 方法和试剂全部开放 方法和试剂全部开放 试剂开放 Roche COBAS AmplicorRoche COBAS Taqman Eppendorf epMotion5075 PCR体系的移液工作站ABI 全自动（油封）加样仪 Agilent 5100 高通量微流芯片分析系统 Caliper LabChip 90 高通量微流芯片分析系统 eGene HDA-GT12 高通量微流芯片分析系统 试剂封闭 试剂封闭 试剂半封闭 TMA PCR 聚合酶链反应(PCR) 和转录介导的扩增系统(TMA)技术 支链DNA检测技术 (bDNA) 连接酶链技术 (LCR) 杂交链捕集法(Hybrids Capture) 链置换扩增 (SDA) 这些技术或因为自身原因,或因为刚研发出来尚未进入临床,均未在血液筛检中应用。 当天 可稍迟 结果和报告 不必要 必要 巢式PCR 不必要 必要 多重PCR 视收费而定 达标的国产试剂，价格较低 试剂费用 可以用手动或半自动 高 自动化程度 必须确诊，排除假阳性 粗筛时可允许很少量(如0.01%)，然后确诊排除 假阳性和确诊 视检测灵敏度和临床需要而定 必须排除假阴性(在某种Cut off标准下) 假阴性 视需要而定，HIV50IU/ml，HCV和HBV，约在300IU/ml 50IU/ml＞95%检出 灵敏度 1 5—24 Pool 系数 每天的几十个标本 在国家实行集中检测时中心血站每天至少要筛几千个标本 高通量 临检要求 血筛要求 性能 起始体积 Pool系数 用血量/袋（μl） IU数 IU/PCR（10μl洗脱液） 洗脱液IU/100μl 样品提取产率估计值（%） 浓度 IU/ml Pool