定量蛋白质组学研究.doc

定量蛋白质组学研究中的荧光差异凝胶电泳技术要开展蛋白质组学研究，双向电泳是你必须了解掌握的最基础的蛋白质分离技术，正如普通凝胶电泳对于核酸纯化。可是一提起双向电泳，多数人还是会直皱眉头别摇头摆手又叹气啦，今天的双向电泳早已深入改进了，特别是其中最热门的荧光差异凝胶电泳技术(DIGE)，因为消除了传统双向电泳的一些弊端，已经使得好多实验室对双向电泳重拾信心，并逐渐得到越来越多的科学家的认同。要知道基于双向电泳的蛋白质组分析文献每年都稳步增长，采用DIGE技术进行研究的科研论文的比重从2004年的不到2%猛增到2008年的19.6%呢。来吧，放下偏见，不要错过，跟着重新认识这功能强大的DIGE吧。前尘往事一直备受争议的双向电泳何以这么不招人待见呢?长话短说。生物样品中蛋白质的复杂多样性远超核酸，使得单向电泳无法满足蛋白样品分离分析的需求。1975年O`Farrell首次介绍了双向电泳技术，采用等电聚焦和SDS在等电点和分子量两个方向上对蛋白质进行分离，使得原本密密麻麻都挤在一条泳道上的蛋白质得以在另外一个方向上有效分开。这个在当时极具创意的设计虽然被写进了教科书中成为经典技术，可惜在随后的实际应用中却遇到种种问题。由于当时第一向电泳的基质是采用两性电解质配置pH梯度胶，两性电解质的不稳定性导致等电点聚焦结果严重受到实验室条件和操作手法等偶然因素的影响，第二向电泳结果就更不用说了即使不是差之毫厘缪之千里，这种不确定性也导致了双向电泳结果可重复性差，稳定性差。不单各实验室之间的结果难以比较，即使同一实验室的结果也不怎么确定。我们都知道，实验的可重复性是实验可信度的重要指标，也是同行评议的重要基础。这种不稳定导致的争议可想而知。用不确定的方法研究不确定的未知，会“负负得正”吗?不可能。再加上操作和结果分析的极其复杂，难怪一提起双向电泳，人人皱眉。直到上世纪九十年代，安玛西亚公司(通用电气生命科学的前身)推出了商品化的固相pH梯度胶条，极大的提高了等电聚焦的可重复性，这才使得国际上不同实验室间双向电泳实验结果比较成为可能。可是双向电泳技术，依然是不可替代的，具有其他任何分离技术无法比拟的高分辨率，可以看到相应蛋白质的等电点和分子量信息，对于蛋白质的翻译后修饰和Isoform也可以清晰展示。因此，尽管当时争议不断，一些科学家和生物技术公司依然青睐2D技术，依然不懈地针对双向电泳的缺点而努力进行技术改良。不比不知道比较，是一种习惯，一种本能，也是一种学问。从学生时代“期末考试第几名?”，到如今人人热衷的各种的xxx排行榜，以及五花八门的比赛，从不间断地彰显人们对比较的热爱。在生命科学研究领域，比较更是一种探索求知的最重要的手段肿瘤组织和正常组织有什么不同?从同一细胞中分化而来的不同组织有何差异?不比不知道，经过各种比较手段找出差异，再研究这些差异的前因后果，一直是生命科学领域最常用的研究思路。核酸表达差异的研究方法包括差异显示，芯片技术，DD-PCR等等，但核酸表达差异的研究最终无法替代蛋白质差异研究。比较不同样品间蛋白质的种类和量的差异，依然是另一个重要的研究方向。由于双向电泳具有其他任何分离技术无法比拟的高分辨率，可以看到相应蛋白质的等电点和分子量信息，对于蛋白质的翻译后修饰和Isoform也可以清晰展示。因而成为蛋白质表达差异研究的重要手段。然而，双向电泳的胶间差异仍然很大，即使应用现在很高级的双向电泳分析软件，仍然有很多蛋白质斑点无法正确匹配。即使那些匹配的蛋白点之间也无法确定其准确的定量关系。较大的系统误差导致该技术无法有效地区分系统误差和样品间的差异，因此需要需要花费大量的时间和劳动运行重复胶以期得到更准确的定量结果。缤纷荧光照亮双向电泳多色荧光标记绝对是伟大的技术发明，正是缤纷的荧光世界使得实验不再受困于孤独的单色标记，同时进行“多重Multiplex”检测成为可能。无论是高通量测序、定量PCR，芯片，流式，细胞成像，染色体原位杂交等等领域，多色荧光标记都有着极为重要的应用(详细请看新技术专栏)。1997年，Unlu等发表了第一篇荧光差异凝胶电泳的论文，将不同的样品分别用不同的荧光染料进行标记后混合在同一块凝胶中进行双向电泳，极大地提高了实验结果的重复性和定量的准确性。2001年，Tonge等以小鼠肝脏作为实验材料，评价了该实验方法，并给予了很高评价。安玛西亚公司(现在的通用电气公司)从Carnegie Mellon大学购买了这种多通路荧光技术和双向电泳技术结合的专利后，全面系统地发展改进了荧光差异凝胶电泳技术，一如前面提及，如今的Ettan DIGE使得许多实验室对双向电泳重拾信心，并受到越来越多科学家认同。相比传统的双向电泳，Ettan DIGE技术究竟有哪些独特的创新和改进使之更胜一筹呢?三色荧光标记传统的双向电泳胶间差异