大鼠LEAP2基因克隆与小型发酵高效表达.pdfVIP

摘 要 目的：本论文以大鼠为实验材料，探讨了LEAP一2在正常大鼠盯脏、大肠、 小肠、脾、心脏、脑、肾、胃、肌肉、以及感染大鼠的肝脏等组织材料中的mRNA 表达情况并对其中表达丰度量高的肝脏LEAP一2进行了克隆及酵母表达，对真 核酵母表达进行了小型发酵工艺流程方向的探索。 方法取正常大鼠肝脏、大肠、小肠、脾、心脏、脑、肾、胃、肌肉、以及 感染大鼠的肝脏等组织材料，提取总RNA，借助于G3PDH持家基因进行相对 定量，对上述10种组织材料种的LEAP一2mRNA的表达丰度进行了研究；取正 常肝脏组织材料，提取总IⅢA后进行R1二PcR、克隆、转化、筛选阳性克隆并 举行序列测定，应用生物信息学对测序结果进行虚拟化分析和同源性比较：经 酶切、转化，将LEAP．2基因定向克隆于真核巴斯德毕赤酵母表达载体PA0815， 经甲醇诱导表达得到表达产物；应用小型发酵罐对LEAP一2进行工艺流程优化。 结果大鼠LEAP一2的表达丰度从高到低依次为：感染大鼠的肝脏、肝脏、 小肠、脾、心脏、大肠、脑、肾、胃、肌肉；克隆了LEAP一2基因全长，获基 因登录号：DQ066720；构建了LEAP．2真核巴斯德毕赤酵母表达载体 pPIC9／LEAP一2，并成功的进行了甲醇诱导表达，与原核系统表达不同的是，该 系统直接表达产物到培养液种，为大量纯化奠定了基础；对LEAP一2基因进行 了小型发酵，并对其中一些具体工艺进行了优化，发现1％甲醇、pH6．O、48h 是最佳发酵条件 结论大鼠各种组织当中，肝脏LEAP一2表达丰度最高；生物信息学表明： LEAP一2基因及其蛋白质产物是一种相当保守的小分子，提示其意义在进化过程 种意义重大；小型发酵试验表明：在1％甲醇、PH6．O、48h的情况下，LEAP．2 产物表达量最高。 关键词：LEAP一2基因，相对定量，定向克隆，真核酵母表达系统，小型 发酵，pPIC9质粒 n ABSTRACT rat Aim：Inthis wasstudiedinIOdi疏rent paper，LEAP-2geneexpression intestine，small stomach， tissues：liVer，1arge muscleandinfectedliye￡LEAP-2 clone(1 was fromliver￡issueu，h；ch gene leveland in t}lesmall-scale llighest expressedⅡle expressedyeast．FoIlo、Ⅳedby was and was 4 tecllIliquesexploredoptimized．The parts． experimentcomposed was Methods：TotalRNAisolatedf’rom liVer’la唱eiilteStine，smallimeStine， andinfectedliverinrat．RT．PCRwaS spleen，hean，brain，kidney，stomacll，muscle doneto the studyLEAP一2mRNA