分子生物学试验-化学与生物工程学院.PPT

制胶原理 胶的浓度取决于Acr和Bis的浓度 Acr Bis + PA AP TEMED In general, use a 5% gel for good resolution in 50-200 kDa range, 10% for 15-75 and 15% for 10-35. Gradient gels (4-15 or 20%) 制胶流程 分离原理 一、四个不连续性 1. pH不连续 2. 缓冲液离子成分不连续 凝胶孔径不连续 电势不连续 分离原理 二、三种物理效应 浓缩效应 分子筛效应 电荷效应 SDS的作用 1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。 2、试剂：上游引物、下游引物、Taq酶、dNTP、模板等 三、仪器与试剂 四、实验步骤 制胶 样品制备及处理 电泳 SDS电泳仪 琼脂糖凝胶电泳 考马斯亮蓝染色 凝胶成像观测实验结果 注意事项 丙烯酰胺在聚合之前有神经毒性，聚合之后毒性消失。 过硫酸铵需当天配制。 注意带好口罩、手套等防护设备。 聚合酶链式反应（PCR）的原理类似于天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA特异性扩增2n倍。 二、实验原理 1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。 2、试剂：上游引物、下游引物、Taq酶、dNTP、模板等 三、仪器与试剂 四、实验步骤 1.反应体系（50ul） 模板 3ul 上游 1ul 下游 1ul 10xbuffer（Mg2+） 5ul dNTP 4ul Taq酶（3U/ul） 0.5ul ddH2O 36.5ul 反应体系 2.反应程序 94℃ 5min 94℃ 30s 56℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 10min 反应程序 32 cycles PCR扩增仪 琼脂糖凝胶电泳 EB 染色 注意：EB具有强致癌性 凝胶成像观测实验结果 注意事项 本次试验由于很多剂量都只有微升级，所以一定要对移液器的正确操作。 注意带好口罩、手套等防护设备。 分子生物学实验 苏州科技学院化学与生物工程学院 实验一 植物基因组DNA的提取 一、实验目的 通过本实验学习从植物中提取DNA的方法。 利用液氮对植物组织进行研磨，破碎组织与细胞。 细胞提取液中的SDS溶解膜蛋白破坏细胞膜，蛋白质变性沉淀。 EDTA抑制DNA酶的活性。 利用酚、氯仿抽提去除杂蛋白。 冷乙醇沉淀DNA。 冰浴或65℃水浴有利于抑制DNA酶的活性。 二、实验原理 1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。 2、试剂：细胞提取液，酚/氯仿，乙醇，TE等 三、仪器与试剂 四、实验步骤 1.取1g新鲜幼嫩植物叶片 2.液氮中研磨成粉，转移至1.5ml EP管中 3.加入裂解液600ul，酚60ul，氯仿600ul 4.轻轻混匀，置于65℃水浴20min 5.12000rpm，15min 6.取上清，加入等体积酚/氯仿，混匀 7.12000rpm，5min 实验流程 水相，酚相 蛋白质 有机相 8.取上层水相，加两倍体积的冷乙醇，1/10体积NaAc 9.冰浴静置约20min 10.12000rpm，5min 11.弃去上清，取沉淀，用70%乙醇洗三次 12.稍干燥，用50ul TE溶解（65℃） 13.上样电泳 琼脂糖凝胶电泳 14. EB 染色 注意：EB具有强致癌性 15.凝胶成像观测实验结果 注意事项 操作时，动作尽量轻柔，避免机械剪切力引起的DNA断裂。 操作过程中注意防护，避免受到伤害，包括液氮、酚、氯仿、EB等化学药品。 实验二 植物基因组总RNA的提取 一、实验目的 通过本实验学习从植物中提取总RNA的方法。 利用液氮对植物组织进行研磨，破碎组织与细胞。 利用异硫氰酸胍作为强变性剂，破坏内源性RNase、多糖、蛋白质。 利用DEPC抑制外源RNase活性。 利用酚、氯仿抽提去除杂蛋白。 异丙醇沉淀RNA。 冰浴或65℃水浴有利于抑制DNA酶的活性。 二、实验原理 1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。 2、试剂：异硫氰酸胍，DEPC，酚/氯仿，异丙醇，TE等 三、仪器与试剂 四、实验步骤 1.取1g新鲜幼嫩植物叶片 2.液氮中研磨成粉，转移至1.5ml EP管中 3.加入变性液600ul，NaAc 60ul，混匀 4.加入600ul酚/氯仿/异戊醇，震荡，冰浴15min 5.4℃，12000rpm，10min 6.取上清，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃，30min 7.4℃，12000rpm，10min 实验