新生儿疾病筛查技术讲解演稿.ppt

新生儿疾病筛查中心 仪器和材料 仪器：荧光读数仪 自动洗扳机 振荡仪 3 mm打孔器 加样器 新生儿疾病筛查中心 材料：商品化试剂盒，包括茚三酮、 L-亮氨酸-L-丙氨酸、琥珀 酸盐缓冲液、铜试剂、标准 品、质控品、酶标板等。 新生儿疾病筛查中心 操作步骤 1.用3mm打孔器分别将标准品、质控品、待测血标本打下，依次放入酶标板内。 2.每孔加入80?l的80%乙醇，室温振荡30分钟，900转/分。 3.转移50 ?l洗脱液至另一块酶标板。 4.加50 ?l反应混合液，振荡1分钟后， 37℃温育2小时。 新生儿疾病筛查中心 5.每孔加200 ?l冷的铜试剂，冷却反应混合物至室温。 6.室温放置15分钟。 7.加入铜试剂后15~30分钟内，在波长485nm处，测定每孔的荧光强度。 结果判断 可用电脑酶标工作软件，自动绘制标准曲线，计算标本的苯丙氨酸浓度。 新生儿疾病筛查中心 干血滤纸片促甲状腺激素的 测定方法 ?酶免疫分析法 ?荧光酶免疫分析法 ?时间分辨荧光免疫分析法 新生儿疾病筛查中心 酶免疫分析法 又称为酶联免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 。酶免技术是以酶标记抗体或抗原作为主要试剂，与标本中待测的相应抗原或抗体反应后，通过标记物的放大作用，检测出标本中的待测物质。该方法的特点是具有高度的特异性和敏感性。新生儿甲低的筛查使用的是双抗体夹心法测定干血滤纸片中的抗原hTSH浓度。 新生儿疾病筛查中心 原理 利用固相反应板包被抗hTSH抗体，成为固相抗体反应板，加入直径3mm的被测定的干血滤纸片、标准干血滤纸片、质控干血滤纸片和酶标记抗体液（辣根过氧化物酶，hTSH-HRP),通过一定时间的反应，由于两种单克隆抗体所抗hTSH相位上的不同，在反应体系中，从干血滤纸片、标准干血滤纸片、质控干血滤纸片中溶出的 hTSH都能与固相抗体和酶标记抗体同时结合，形成双抗体夹心抗原hTSH的复合物。待反应稳 新生儿疾病筛查中心 定后，滤纸片和血液中的其他成分以及游离的过量酶标记抗体经洗涤而被去除，此时反应体系中被测物质的含量与酶成一定的比例关系，然后加入酶作用的底物，经酶对底物一定时间的催化作用，使底物变成可测定的产物，最后通过酶标仪读出产物的吸收值。此读数的高低与被测物TSH的含量成正比。通过与在同等条件下测得的标准值比较由绘制的标准曲线计算出未知标本中hTSH的含量。 新生儿疾病筛查中心 试剂和材料 1.试剂盒的组成：包被抗hTSH抗体的96孔固相反应板、酶标记的抗hTSH抗体复合物、酶反应底物（四甲基联苯胺TMB）、显色剂稀释液、标准干血滤纸片1套、终止液等。 2.仪器： 酶标读数仪（配备电脑）、振荡仪、洗扳机、打孔器、自动多道可调移液器等。 新生儿疾病筛查中心 操作步骤 1.试剂的准备：试剂盒从冰箱那出后恢复至室温再用。部分试剂使用前现用现配，试剂打开后要在有效期内使用。 2.将未知样品编好号后，和标准品、质控样品一起，用3mm打孔器打下来，加入96孔包被板。标准品和质控品为重复双管。 3.加洗脱液，振荡孵育，4℃静置过夜。 4. 弃去反应液、纸片、洗涤。 5.加入酶标记的抗体，振荡孵育。 新生儿疾病筛查中心 6.加入显色剂，避光反应30分钟。 7.加终止液，酶标计数仪450nm处读取吸光值。 结果计算和判断 以标准系列的吸光值为纵坐标（Y轴）， hTSH浓度为横坐标（X轴）绘制标准曲线坐标图。未知样品浓度可通过电脑自动计算出来。 如果干血滤纸片TSH浓度大于切值，需要对原干血滤纸片标本复查。复查TSH值仍大于切值的，应招回新生儿，采取静脉血测定T3、T4、 TSH、FT3、FT4，进一步确诊该新生儿是否患有先天性甲状腺功能低 新生儿疾病筛查中心 时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA） 也称为“解离扩增镧系荧光免疫分析法（DELFIA）。 是20世纪80年代问世的一种非放射性免疫分析方法。主要特点是以稀土元素作为示踪剂标记抗原或抗体，这些稀土元素如铕（Eu3+)、钐（Sm3+)等，与待测物反应形成的螯合物经紫外线激发不仅荧光强度高，且衰变时间长。 Eu3+和Sm3+的荧光衰变分别为430微秒和41微秒，而样品