如何做好Western-blot免疫印迹.ppt

如何做好Western-blot（免疫印迹）随意谈 印记法 印迹（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用探测物特异性检测未知样品的方法。 1975年，Southern将DNA转印到硝酸纤维素（NC）膜上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段，后来称这种方法为Southern印迹法。 印记法 Western-blot 高灵敏度、高特异性的蛋白检测 应用于绝大多数生物、医学实验室 成熟的技术、丰富的方案选择 主要步骤 样品制备 电泳 转膜 封闭 结合抗体 发光（显色） 信号检测 样品制备 细胞裂解 蛋白溶解（可一步完成） 蛋白定量 细胞裂解 离子型去垢剂（SDS） 非离子型去垢剂（N-P40，TritonX-100） Tris、NaCl、叠氮化钠、正钒酸钠等 蛋白酶抑制剂 EDTA、PMSF、PI cocktail等 超声 研磨 匀浆 反复冻融 样品制备——缓冲液 蛋白的定量 用于蛋白的快速定量方法主要有A280法、Bradford法、Lowry 法三种方法，其中A280法灵敏度为0.2-2 mg/ml，但核酸可引起强干扰作用；Lowry 法灵敏度为5-100 μg/ml，虽相对准确，但干扰物质多且反应速度慢，而且含DTT溶液不宜用此法；Bradford法灵敏度为25-200 μg /ml，由于相对干扰物质较少，且反应时间仅需2分钟,故适合用于大多数研究的蛋白定量。 Bio-rad另有对一种适用于去垢剂增溶蛋白样品的比色测定的试剂盒DC Protein Assay Kit，该方法类似于常规的Lowry方法，但经过改良后，节省了操作时间。DC蛋白测定只需要15分钟的温育时间，而且吸收值读数保持2小时的稳定。RC DC Protein Assay Kit蛋白测定是一种适用于含还原剂和去垢剂的蛋白测定，具有原来DC蛋白测定的特点，并能与更多的试剂兼容，简化了复杂蛋白样品溶液的定量测定。 电 泳 基质及交联剂 基质及交联剂 T%＝ C%＝ 蛋白SDS常用C％：1：29，1：37.5 T%的线性分离范围： 非变性体系 变性体系 适合小分子蛋白分离的Tris-Tricine 体系 预混电泳缓冲液 Premixed Electrophoresis Buffers 161-0732 10x Tris/Glycine/SDS, 1 L 161-0772 10x Tris/Glycine/SDS, 5 L cube 161-0734 10x Tris/Glycine, 1 L 161-0771 10x Tris/Glycine, 5 L cube 161-0744 10x Tris/Tricine/SDS, 1 L SDS－主要设备 Precision Plus ProteinTM 蛋白标准品 条带窄而清晰，分子量准确（经质谱验证），可用于蛋白分子量测算； 未预染的条带标记链亲和素(Streptavidin)亲和肽，可进行Western杂交检测； 包括未预染(161-0363)，预染全蓝(161-0373)，双色(161-0374)和彩染(161-0375) 每种标准品含10个条带，跨度从10KD－250KD。 未染标准品 ——分子量测定 Precision Plus ProteinTM 预染标准品 转 印 印迹膜 硝酸纤维素(NC)膜：历史悠久，蛋白结合力不强，载量较低·Nitrocellulose:载量80-100mg/cm2，孔径0.2/0.45 mm 聚偏四氟乙烯(PVDF)膜：蛋白结合力强，载量较大，使用广泛·Immuno-BlotTM :载量150-160mg/cm2，适于反复洗脱。孔径0.2mm·Sequi-BlotTM ：载量170-200mg/cm2，蛋白结合更牢固，可用于蛋白测序或小分子转印，孔径0.2mm 尼龙(Nylon)膜: 带正电荷，结合力最强，载量最大，尤其适于很小分子转印和生物素显色· Zeta-Probe?: 载量480mg/cm2，蛋白结合最牢固，封闭只需5％脱脂奶粉 缓冲液 Towbin 缓冲液: 25mM Tris, 192mM 甘氨酸, 20% (v/v) 甲醇. Towbin缓冲液+SDS: 25mM Tris, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS, 20% (v/v)甲醇. CAPS缓冲液: 10mM CAPS, 10%甲醇. 乙酸缓冲液: 0.7%乙酸 不同蛋白须用不同缓冲体系和膜 槽式转印系统（湿转） Mini Trans-Blot转印槽 2. Criterion转印仪 Trans-Blot 转印槽 Trans-Blot Plus转印槽 半干转印系统 Trans-Blot SD 半干转印槽 微量过滤及筛选系统 Bio-Dot