2009-1蛋白质的分离纯化.ppt

第一章 蛋白质的分离纯化技术 1）凝胶的聚合 有自由基存在 引发产生自由基的方法 化学法 光学法 ① 化学聚合 催化剂: 过硫酸铵（AP） 加速剂: 脂肪族的叔胺: 其中以TEMED为最好。 四甲基乙二胺（ TEMED） 三乙醇胺 二甲基氯丙腈等 丙烯酰胺、Bis和TEMED的水溶液 过硫酸自由基 TEMED 丙烯酰胺单体 聚合 含有酰胺基侧链的脂肪族多聚链 通过Bis交联 三维网状结构 通常需要痕量氧的存在， ②光聚合: 以核黄素为催化剂， 不加TEMED即能聚合，但加入可加速聚合 过硫酸铵 激活 活化 一般光聚合用于制备大孔胶，化学聚合用来制备小孔胶。 核黄素 光解 无色基 被氧化 自由基 引发 聚合作用 2)影响凝胶聚合的因素 丙烯酰胺，选择电泳纯级的产品。 过硫酸铵溶液需新鲜配制。 ? 试剂的纯度 ? 凝胶浓度 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小取决于反应体系中单体和双体在凝胶中的总浓度(T)和交联度(C)。 通常凝胶的孔径、透明度和弹性随着凝胶浓度的增加而降低， 而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加。 式中a代表单体Arc的重量（g） b 代表交联剂Bis的重量（g） m 代表溶液的体积（mL)。 凝胶浓度的计算公式 T％ = a+b m ? 100％ 交联度的计算公式 C％ = b (a+b) ? 100％ 当a:b 10时 凝胶变硬呈白色； 当a:b100时 5%凝胶呈糊状，且易断裂。 交联度随着总浓度（T）的增加而降低。 因此，当总浓度一定、交联度增加时，将导致筛孔直径降低。 Richard等在1965年提出适合于确定凝胶浓度为5%-20%范围内交联度的经验公式： C = 6.5 - 0.3T 如选用总浓度T分别为5%和10%时，依照上述公式便可计算出交联度C应分别为5%和3.5% Fawcett提出了另一种看法： 当凝胶总浓度不变，交联度为5%时，筛孔直径最小； 大于或小于此交联度时，筛孔直径均变大。 因此，目前有些实验室采用a:b = 19:1的配方。 显然C值可由T值决定的，或者是固定值（5%）。 而T值则依据分离物质的分子质量大小来确定。 标准凝胶: 是指浓度为7.5％的凝胶。。 凝胶浓度过大，凝胶透明度差，而且因其硬度及脆度较大，容易破碎； 凝胶浓度太低时，形成的凝胶稀软，不易操作。 温度高聚合快，温度低聚合慢，一般以23℃～25℃为宜。 在聚合过程中要使反应液与空气隔绝，最好能在加激活剂前对凝胶溶液脱气。 ?温度和氧气的影响 3）分离效应 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为 连续性电泳 不连续性电泳 不连续电泳系统存在四个不连续性： ①凝胶层的不连续性 通常含有3种性质不同的凝胶 ②缓冲液离子成分的不连续性 ③pH值的不连续性 ④电位梯度的不连续性 ①浓缩效应 电泳时会产生3种物理效应 样品的浓缩效应 凝胶的分子筛效应 电荷效应 当样品胶和浓缩胶选用pH6.7Tris/HCl缓冲液、电极液选用pH8.3Tris/甘氨酸缓冲液时（称分离酸性蛋白质的碱性系统），在电泳初期 因浓缩胶中缓冲液的pH为6.7，在该pH下，HCI几乎全部解离释放出Cl?； 甘氨酸的等电点为pH6，故甘氨酸的解离度很小； 血清蛋白质的等电点多数为pH5左右，其解离度在HCI和甘氨酸之间 在这个系统中含有三种带负电荷的离子 Cl? Pr?（蛋白质离子） NH2-CH2-COO?(甘氨酸离子g） 在电场中这三种离子在大孔胶内的有效迁移率的大小顺序依次为 mCl-· ?Cl - （m: 迁移率，?：解离度，m· ? ：有效迁移率） Cl?称为快离子，或前导离子（Leading ion）， 甘氨酸称为慢离子或尾随离子 (Trailing ion）。 ＞ mg · ?g ＞ mPr- ·? Pr - 当电泳刚开始时，由于三种胶中都含有Tris-HCl缓冲液，都含有快离子Cl?,电泳槽中只含有慢离子。电泳开始后，因快离子有最大的有效迁移率，很快超过蛋白质和甘氨酸离子，而使其后面形成一个离子浓度低的区域, 即低电导区. 因为电场强度与电导成反比关系: E代表电场强度，I代表电流强度, ?代表电导率 因此，在低电导区就产生了较高的电场强度。这种环境使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动，致使高、低电势梯度区之间形成一个快速移动的界面. 由于蛋白质的有效迁移率介于快、慢离子之间，蛋白质离子后有甘氨酸离子向前推，前有Cl ?阻挡，蛋白质就聚集在C