全长人pparγ的表达纯化与结构确证.pdf

第３２卷 第２期 世界科技研究与发展 Ｖｏｌ．３２ Ｎｏ．２ 　 　 ２０１０年４月 ２２５－２２９页 ＷＯＲＬＤＳＣＩＴＥＣＨＲ＆Ｄ Ａｐｒ．２０１０ ｐｐ．２２５－２２９ 全长人ＰＰＡＲ的表达、纯化与结构确证 γ 李　伟　杨晓兰　胡雪原　郑晓红　段　雯　夏　铸　余　瑜 （重庆医科大学药学院，重庆４０００１６） 摘　要：目的建立表达、纯化结构完整的全长人ＰＰＡＲ的方法。方法构建ｐＲｅｃｅｉｖｅｒＢ０１ＰＰＡＲ质粒并转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３） γ γ 细胞，诱导表达重组蛋白，优化细胞生长条件；利用亲和色谱和尺寸排阻色谱纯化重组蛋白；胶内酶解重组蛋白，用离子阱质谱仪 分析二维ＡｇｉｌｅｎｔＨＰＬＣＣｈｉｐ纯化的酶解片段；基于ＭＳ／ＭＳ搜索ＩＰＩ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＮＣＢＩｎｒ和ＭＳＤＢ数据库，鉴定重组蛋白。结果 在 优化的细胞生长条件（ＴＢ介质、３７℃、０８ｍＭＩＰＴＧ、诱导３ｈ），从每升ＴＢ中可获得２８０ｍｇ重组蛋白；两步纯化后，获得１７６ｍｇ、纯 度为９５％的均质重组ＰＰＡＲ蛋白；经质谱分析和搜索蛋白质数据库，获得均匀地分布在整个ＰＰＡＲ多肽链中的３３个阳性肽 γ γ 段，覆盖率为６０％，表明重组蛋白为结构完整的全长人ＰＰＡＲ。配体结合活性位点Ｓ２８９、Ｈ３２３、Ｈ４４９和Ｙ４７３无突变，保证全长 γ 人ＰＰＡＲ与配体结合的生物学活性。结论 本文所建立的方法能成功用于大量表达结构完整的全长人ＰＰＡＲ，有利于进一步的 γ γ 结构、功能研究和活性配体的筛选。 关键词：全长人过氧化物酶体增殖物激活受体；表达；纯化；结构确定 中图分类号：Ｑ８１２　　　文献标识码：Ａ　　　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｕｌｌｌｅｎｇｔｈＨｕｍａｎＰＰＡＲ γ ＬＩＷｅｉ　ＹＡＮＧＸｉａｏｌａｎ　ＨＵＸｕｅｙｕａｎ　ＺＨＥＮＧＸｉａｏｈｏｎｇ　ＤＵＡＮＷｅｎ　ＸＩＡＺｈｕ　ＹＵＹｕ （ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００１６） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｖｅｌｏｐａｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｉｎｔｅｇｒｉｔｙｏｆｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｈｕｍａｎｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＰＡＲ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｗｉｔｈｐＲｅｃｅｉｖｅｒＢ０１ＰＰＡＲｐｌａｓｍｉｄｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｔｏｅｘｐｒｅｓｓ γ γ γ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｃｏｎｄ