猪源大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性以及耐药基因的检测.docVIP

猪源大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性以及耐药基因的检测 116养猪SWINEPRODUCTIONf512011 猪源大肠杆菌对氨基糖苷类药物的 耐药性以及耐药基因的检测 薛原,陈建飞,张秀英,赵树臣,田丽红,张彦龙 (1.东北林业大学野生动物资源学院,黑龙江哈尔滨150040; 2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,哈尔滨150001;3.东北农业大学动物医学学院,哈尔滨150040) 中图分类号:$852.61+4文献标志码:A文章编号:1002—1957(2011)05—0116—03 摘要:为指导临床合理用药,根据耐药表型和基因型研究耐氨基糖苷类药物猪源大肠杆菌的流 行情况,采用K—B法检测大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性,同时用PCR技术扩增氨基糖苷类 药物的耐药基因以明确其基因型.结果显示,60株临床分离菌中,耐氨基糖苷类抗生素菌株54 株,耐药率为90%;aac(3)一I基因PCR扩增均为阴性;aac(3)一Ⅱ基因检出阳性28例,阳性率为 46.7%;aac(6)一I基因检出阳性54例,阳性率为90%.结果表明,耐氨基糖苷类药物的大肠杆菌 比较普遍,氨基糖苷类耐药基因以aac(3)一II和aac(6)一I为主. 关键词:大肠杆菌;氨基糖苷类;耐药性 氨基糖苷类抗生素是一类作用于细菌核糖体, 抑制其蛋白质合成的抗菌药物.由于其具有广谱,高 效,优良的抗生素后效应及与B一内酰胺类协同作用 等特点,因此成为临床上抗革兰氏阴性菌感染的重 要药物lll.其耐药机制主要包括细菌细胞膜通透性改 变,细菌的主动外排,靶位点的改变及钝化酶的产 生,其中最主要的为钝化酶的产生.钝化酶主要有氨 基糖苷乙酰基转移酶(AAC),氨基糖苷基磷酸转移 酶(APH),氨基糖苷核苷转移酶(ANT),目前已发现 的有30多种.氨基糖苷类药物修饰酶通常由质粒和 染色体所编码.不同的氨基糖苷类抗生素可为同一 种酶所钝化,而同一种氨基糖苷类抗生素又可为多 种钝化酶所钝化,这是因为一种抗生素的分子结构 中可能存在多个结合点的关系.相同基因型可能对 应不同的耐药表型,这些细菌可能是实际的基因表 达水平不同,也可能是药物代谢速度上有所差异. 1试验材料 1.1试验菌株 药敏质控菌株大肠杆菌ATCC25922,购自中国 兽医药品监察所.试验用大肠杆菌,2010年3—9月 从黑龙江省5个受试养殖场分离鉴定出90株猪源 大肠杆菌,随机选取其中60株用于氨基糖苷类药物 耐药性,耐药表型和基因检测. 1.2药品 普通琼脂,水解酪蛋白琼脂培养基,杭州天和 收稿日期:2011-06—27 基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金(DL09AA005)资助 作者简介:薛原(1978一),女,黑龙江饶河人,讲师,博士,主要从 事动物药理学与毒理学方面的研究.E—mail:xueyuan一1978@163.con 微生物试剂有限公司生产;pMD18一T载体,Taq DNA聚合酶,dNTPBuffer,DL5000Marker等均为 TaKaRa公司产品;庆大霉素,卡那霉素,新霉素,阿 米卡星,均为杭州天和微生物试剂有限公司生产. 1-3主要仪器 PCR扩增仪为德国Biomerta公司产品;凝胶成 像分析系统为美国AlphaImager2200公司产品. 2试验方法 2.1药敏试验 采用WHO(世界卫生组织)推荐的Kirby-Bauer 法,每次测定均以质控菌株为对照,只有当质控菌株 的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株结果才有效. 按抗菌药物敏感性试验扩散法标准判定各菌株的敏 感度,以敏感,中介,耐药3种形式对抑菌圈大小作 出判定. 2.2目的基因扩增 只要对阿米卡星,卡那霉素,新霉素,庆大霉素 其中任意一种抗生素表现耐药,即检测其耐药基因. PCR扩增的模板为菌株质粒DNA.采用25LPCR 扩增体系:模板2IxL,10xBuffer2.5p,L,dNTPs2L, 上,下游引物各0.5L,TaqDNA聚合酶0.25L, 灭菌双蒸水加至25txL.引物[21由上海英骏生物技术 有限公司合成.反应条件:95℃预变性15min;94℃ 变性1min,58℃退火1min,72℃延伸1rain,共30 个循环;72℃延伸10rain.PCR扩增产物用1%琼脂 糖凝胶电泳分析,aac(3)一I基因目的片段为169bp, aac(3)一1I基因目的片段为237bD,aac(6)一I基因 目的片段为394bD. 2011第5期薛原,等.猪源大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性以及耐药基因的检测117 2.3目的基因序列测定 将回收纯化的PCR产物与pMD18一T载体进行 连接反应后,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞.碱裂 解法提取质粒,经PCR初步鉴定,随机选取阳性质 粒委托北京六合华大基因科技股份有限公司