荧光定量PCR 3-24.pptVIP

结核性腹膜炎的诊断现状课件浅表淋巴结诊断对有出境竹木草制品生产企业质量管理体系要求课件输液反应的相关处置课件 实时荧光定量PCR技术的实验操作 (Real time Quantitative PCR) 例子：加药处理后，各实验HUVECs中Cx37,Cx40,Cx43的RNA表达情况 本实验分为六组：Con，LPC,+Rut(L), +Rut(M),+Rut(H),+Rut(H)+CAPZ 培养HUVECs细胞，加药处理后，提RNA. 一、RNA的提取 提取RNA: 注意RNA降解和污染（带上口罩，不要讲话）RNA提取后我们要分装，分5ul用来跑电泳（验证RNA是否提取成功）；分5ul用来测浓度；剩余的用来逆转录（当天提的RNA,应立刻拿去逆转录）。 RNA跑电泳：28S rRNA的量为18S rRNA的量的两倍，说明RNA提取成功。（不能有杂带） RNA浓度检测：使用分光光度计。5ul的RNA稀释40倍成200ul通过OD260/OD280来检测，其值在1.8-2.0说明RNA纯度较好。CRNA=OD260×稀释倍数×40（ug/ml）。 二、逆转录 RNA定量：根据RNA的浓度，计算相应的RNA的量和RNase-free water的量。（使用试剂盒逆转录） 逆转录成cDNA后，最好尽量做PCR。 三、准备物品 使用TaKaRa的PCR反应液 本实验6个组：Con,LPC,+Rut(L),+Rut(M),+Rut(H)，+Rut(H)+CAPZ组的cDNA. SYBR Green PCR Mix: 引物（GAPDH，Cx37，Cx40, Cx43 ）。 八连管 要求做复管（2管）： 6*4*2=48 四、配制PCR反应液 配Mix液各组单独配制，在冰上进行。SYBR Green I 要避光，用锡箔纸。(尽量多配一管的量) 例如：Con组：SYBR Green I 10ul×9=90ul Rox Dye II 0.4ul×9=3.6ul RNase-free water 6.8ul×9=61.2ul 混匀，分装4个EP管，40ul/管 各管中加入0.8ul的F+0.8ul的R+4.0ul的cDNA，混匀，在小离机上离心一下，分装于8连管（勿接触手和水，必须带橡胶手套），20ul/管(8连管盖子要做好标记，写在左上角，尽量写小点)，必须精准，用较准确的移液枪，在小离机上离心一下， 五、上机 打开电脑。密码：重复用户名，接PCR仪电源：自检至有Power亮，放置PCR管，记住各个管的位置。 打开软件：桌面上的7500 software OK 选择 Set up advanced setup 一. Experiment Properties Experiment name (写上当天的实验日期) 7500（96 well）Quantitation-comparativeCt(▲▲Ct) SYBR Green Reagents 结核性腹膜炎的诊断现状课件浅表淋巴结诊断对有出境竹木草制品生产企业质量管理体系要求课件输液反应的相关处置课件