第七章 菌种保藏.pptVIP

一、 菌种衰退的现象 1. 菌落和细胞形态改变 2. 生产性能下降 3. 对生长环境的适应能力减弱 二、 菌种衰退的原因 1. 有关基因的负突变 2. 育种后未经很好的分离纯化 3. 培养条件的改变 4. 污染杂菌 思考题 什么是菌种的衰退？ 如何防止菌种的衰退 3．每支斜面加入2ml 20％的脱脂乳，然后用巴氏吸管将斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌体均悬液，最终菌株浓度一般要求在106CFU／m1．用细菌浸没培养物来保藏时，加入40％的脱脂乳，混合制成含106CFU／ml的均悬液。 思考题 菌种保藏的原理是什么? 常用的菌种保藏方法有哪些？ (二)操作步骤 1．启动冷冻干燥器的致冷单元。当冷凝器的温度达到-40℃时启动真空泵，使真空度达到2.67～4.00Pa。 2．将冷冻槽置于歧管之下方。槽中装入2／3体积的异丙醇，然后插入温度计及可调温控仪降温探头．打开降温探头控制醇浴温度在-40℃，这—过程约需30min。 4．取下安瓿上的棉塞，然后用lml移液管分装安瓿(0.2ml／瓿)，重新塞好棉塞。 5．轻轻振荡安瓿，以使细胞重新悬浮。将安瓿与歧管相联后迅速置于醇浴中，然后调节温控装置。使细胞悬液迅速冻结。 6．15min后，将歧管与真空泵相通。 7．维持-40℃的醇浴温度90-120min，然后调节温控装置。使醇浴温度上升至-10℃，维持2h。 8．关掉可调温控装置的降温探头，让醇浴温度上升至室温(25℃)． 9．在冷冻干燥的最初4h内应定期测真空度，在安瓿置于真空下后1h内，真空度必须达到13.33Pa，并于菌悬液接近干燥时逐渐降到2.67～4.0Pa。 10 ．在真空状态下，让安瓿保存在冷冻干燥机中至少16h以获得完全干燥。 11．干燥后，在2.67～4.00Pa的真空度下封瓶． 12．在所有安瓿都封盖好后，撤去真空。 13．关闭真空泵。 14．关闭冷凝器。 (三)冻干菌种的保藏与再生 1．保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。 2．复苏： (1)在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。 (2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿． (3)在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。 (4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。 第四节 其他保藏方法 一、 斜面冰箱保藏法 二、 石蜡油封存法 三、 砂土管保藏法 不同菌种保藏方法比较 基因工程菌的保藏（了解） 由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。 一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。 当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。 我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。 微生物活力和稳定性测定 所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。 在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。 对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。 加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。 成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)。细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要。 第七章 菌种保藏 第一节 菌种的衰退 第二节 冷冻保藏 第三节 冻干保藏 第四节 其他保藏方法 第一节 菌种的衰退 一、 菌种衰退的现象 二、 菌种衰退的原因 三、 防止衰退的措施 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异 b）污染 c）死亡 菌种衰退的现象及原因 常见的菌种退化现象中，最易觉察到的是菌落形态、细胞形态和生理等多方面的改变随着菌种保藏时间的延长或菌种的多次转接传代，菌种本身所具有的优良的遗传性