生化——蛋白质分离纯化技术知识.pptVIP

蛋白质的分离、纯化和结构分析;蛋白质分离指利用其理化性质，采取透析、盐析、电泳、层析以及超速离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法，以满足研究蛋白质结构域功能的需要;一、透析和超滤法可除去蛋白质溶液中的小分子化合物 利用透析袋分离蛋白质的方法叫透析发，透析袋是具有超小微孔的膜，一般只允许分子量为10kD以下的化合物通过，高分子蛋白则留在袋内;二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀法;三、利用电泳法分离蛋白质;1) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE);聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），它以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量： ;2) 等电聚焦（isoelectric focusing）;(1) 离子交换层析（ion-exchange chromatography);离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。 离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。;(2) 凝胶过滤（gel filtration chromatography）; Gel filtration. This method separates proteins according to size. ;柱床体积为Vt 外水体积为Vo 内水体积为Vi 基质体积为Vg， 则有： Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有： Vt＝Vo＋Vi ;五、超速离心分离; 沉降系数：生物大分子、亚细胞器和微生物等颗粒在单位离心场中的沉降速度为沉降系数（s）。单位用S，即Svedberg单位，为1×10-13秒。 （mp：颗粒质量；v ：偏微比容；?：溶剂密度；f：摩擦系数） S与颗粒的质量和密度、溶剂的密度和粘度有关，可根据沉降系数的不同来分离和检定生物大分子、亚细胞器和微生物。;六、应用化学或反向遗传法分析多肽链氨基酸序列;七、应用物理学、生物信息学原理测定蛋白质空间结构;目前几种测定蛋白质结构的方法1、同源建模 被认为是目前最精确的方法2、折叠识别 通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其他蛋白质的空间结构，从而产生目标序列的三维???构3、从无到有 根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列的三维结构;谢谢大家黄嵩