03氨基酸育种及扩大培养.pptVIP

目 录 Chapter1 L-谷氨酸菌种选育及培养过程 Chapter2 L-缬氨酸育种 Chapter1 L-谷氨酸菌种选育及培养过程 遗传稳定性试验 将目的突变株GDK-9进行单菌落分离，连续摇瓶传代10代，并进行遗传标记验证和摇瓶发酵产酸试验，结果见表 种子扩大培养的过程 斜面菌种的培养 菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。 一级种子培养 一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。 二级种子培养 为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。 种子罐配料顺序 首先，将配料池中冲洗干净，所用糖液尽量用新鲜糖液，依次将水（配料池的2/3体积）、葡萄糖、玉米浆、糖蜜、尿素（用液氨的不用）、磷酸氢二钠、氯化钾（溶液）加入配料池中，用NaOH稀溶液调pH ，然后取样分析，加消泡剂，加水定容至刻度线待打料，配料过程中，搅拌始终开启。正确的配料顺序是为了保证培养基的初OD值低和减少培养基副反应发生。 培养基构成 种子培养基的营养成分应适合种子培养的需要，一般选择一些有利于菌体生长的培养基，在营养上易于被菌体直接吸收和利用，营养成分要适当地丰富和完全，氮源和维生素含量较高，碳源含量少，这样可以使菌丝粗壮并具有较强的活力。 如果糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生有机酸，使pH降低，菌种容易衰老。 培养基的营养成分要尽可能地和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，这样的种子一旦移入发酵罐后也能比较容易适应发酵罐的培养条件。 发酵培养基一般比较浓，而种子培养基以略稀薄为宜。 温度 种子培养应选择最适温度, 幼龄菌对温度变化敏感，应避免温度过高和波动过大 pH 种子培养基的pH值要比较稳定，以适合菌的生长和发育。pH值的变化会引起各种酶活力的改变，对菌体形态和代谢途径影响很大。种子培养的初始pH不宜过高，培养结束时pH不宜过低。 溶解氧 培养过程中通气搅拌的控制很重要，各级种子罐或者同级种子罐的各个不同时期的需氧量不同，应区别控制 一般前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大供氧量。 在种子制备过程中，如果溶氧水平过高，会抑制长菌。 生产过程中，有时种子培养会产生大量泡沫而影响正常的通气搅拌，此时应严格控制，甚至可考虑改变培养基配方，以减少发泡。 接种量 移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例，称为接种量。 接种量的大小与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度有关。 生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施。 采用大接种量，种子进入发酵罐后容易适应，而且种子液中含有大量的水解酶，有利于对发酵培养基的利用。大接种量还可以缩短发酵罐中菌体繁殖至高峰所需的时间，使产物合成速度加快 过大的接种量往往使菌体生长过快、过稠，造成营养基质缺乏或溶解氧不足而不利于发酵。 接种量过小，则会引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期延长，影响种子活力，导致发酵异常等等。 种龄 种子培养时间称为种龄 菌体在生长发育过程中，不同生长阶段的菌体的生理活性差别很大，接种种龄的控制就显得非常重要。 在发酵生产中，种子培养时间不宜太长，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期, 菌体量尚未达到最高峰时移种 种龄过于短的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、泡沫多，发酵周期延长以及因菌体量过少而引起异常发酵等等 种龄过老的种子接入发酵罐后，则会因菌体老化而导致生产能力衰退 Chapter2 L-缬氨酸育种 育种标记及其育种目的 出发菌株的选择 本研究以黄色短杆菌TV10为出发菌株，在进行诱变育种试验之前对该菌进行形态观察并对菌体的某些性状进行了鉴定。 菌体生长曲线的测定 取新鲜活化斜面菌种，接入装有25mL完全液体培养基的250mL三角瓶中，32℃，200r/min，振荡培养16~18h后，取 1mL菌液到另一相同的完全液体培养基中继续培养，每隔一定时间取样，用蒸馏水稀释20倍后，用752分光光度计于光程1cm、波长620nm条件下测量吸光度（A620nm）。以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制菌体生长曲线 原生质体紫外诱变 菌体前培养 取新鲜活化斜面菌种于完全液体培养基中，32℃，200r/min，振荡培养12h后，取 1mL菌液到另一完全液体培养基中继续培养6h，加入终浓度为0.6U/mL的青霉素，继续培养3h。 原生质体形成 取上述经青霉素预处理过的菌液5mL于离心管中，4000r/min离心10min，弃上清，用高渗液离心洗涤2次后，配