第17章讲基因工程-生物化学.ppt

(插入失活法) 抗药性标记选择 α 互补的检测 （二）PCR法 （三）核酸杂交筛选法 特点是高度特异性及高度灵敏性 如：菌落杂交(colony hybridization) （四）活性筛选 根据目的基因编码有特殊生化活性的蛋白质（如：某些酶类）来筛选和鉴定 表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 五， 目的基因的表达 1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用） 表达载体： 选择标记、强启动子 、诱导调控序列 E.coli表达体系的优点： 技术成熟，表达量高，易调控 E.coli表达体系的不足 ： 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济 导入方法： 磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2. 真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 表 表达目的基因 目 录 第十七章 基因重组和基因工程原理 第一节 基因工程概述 转化作用 (transformation) 自然界的DNA重组 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 转 座 (transposition) 同源重组 (homologous recombination) 位点特异的重组(site-specific recombination) 细菌的接合作用 当细菌细胞通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。 转化作用 细胞摄取周围环境中游离的外源DNA，从而表现新的遗传性状的过程，称为转化作用 (transformation)。 例：一个细菌死亡后菌体溶解，裂解的小片段DNA被另一细菌摄取。 转导作用 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来时，可能会带有供体细胞的DNA片段，再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移即为转导作用(transduction)。 基因工程的目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 基因工程： 是指在体外将DNA分子“剪切”并重新“拼接”形成一个新的重组DNA分子，然后将它导入细菌或动物细胞内使之表达，产生出人类所需要的基因产物或改造新的生物品种。 基因重组： 来源不同的DNA组成一个新的DNA分子的过程。 一、基因重组与基因克隆的概念 二 基因工程原理简图 分(分离或合成)∶是指获取目的基因的过程。 切（切割）∶用限制性内切酶切割将目的DNA和载体，形成特殊的末端。 接（连接）∶目的DNA和载体连接成重组DNA分子。 转（转化）∶将重组DNA分子植入宿主细胞。 筛（筛选、鉴定）∶挑选出含有目的基因克隆。 表（表达）∶将目的基因的生物学功能表现出来。 载体（vector） 定义：能携带目的基因进入宿主细胞，并实现自我复制或表达蛋白质的小片段DNA。 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA 克隆载体(cloning vector) 能使插入的外源DNA在克隆宿主细胞内复制并稳定保存的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 能使插入的外源DNA在克隆宿主细胞内转录翻译成蛋白质的载体称为表达载体。 载体应具备的基本特点 有复制起点，能自主复制； 具有（两个以上）遗传标记物，如抗药基因，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），称为多克隆位点； 表达载体具备与宿主细胞相适应的调控元件（启动子、前导顺序、增强子等）。 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 1. 质粒载体 特点：能在宿主细胞内独立自主复制，操作简单，容量较小。 λ噬菌体DNA改造系统 柯斯质粒(cosmid)载体，容量较大，与包装蛋白配合使用，转化效率高。 2. 噬菌体DNA M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） pUC系列：高拷贝，具有α互补特性，便于筛选。 酵母人工染色体 (yeast artificial