复旦大学《生物制药技术》教学-单克隆抗体.pptVIP

双链scFv与抗原结合比单价scFv更敏感、亲和力更高，这种双价抗体在结构和功能上更接近亲本天然抗体。 如将特异性不同的两个小分子抗体连接在一起，则可得到双特异性抗体，亦称双功能抗体，其两个抗原结合部位具有不同的特异性。 （五）双链抗体 双特异性抗体（bispecific antibody，bsAb） 是含有两个不同配体结合位点的抗体分子。它有两个不同的抗原结合部位（两个臂），可分别结合两种不同的抗原表位。其中一个臂可与靶细胞表面抗原结合，另一个则可与效应物（如药物、效应细胞等）结合，从而将效应物 直接导向靶组织细胞。 （六）抗体融合蛋白 将抗体片段（例如V区或C区）连接到与抗体无关的其它蛋白（如毒素、细胞因子、葡萄球菌蛋白A、碱性磷酸酶、T细胞受体等）上，就可创造出一些抗体相关分子，称为抗体融合蛋白（antibody fusion protein）。 分二大类： 1. 将抗体的Fv与其它生物活性蛋白结合; 2. Fc段与某些有黏附或结合功能的蛋白质融合而获得的融合蛋白。 Fv抗体融合蛋白 肿瘤导向治疗是主要应用领域。 免疫毒素:将单抗与毒素连接而成，通过抗原与抗体的 特异性结合，将毒素连同抗原抗体复合物一并“内化 ”进入细胞，发挥其阻抑蛋白质合成或破坏DNA结构 等作用。 2. Fc抗体融合蛋白 将具有Fc段与某些有黏附或结合功能的蛋白质融合而获得的融合蛋白，又称免疫黏附素。 ①通过与抗体或蛋白A结合用于检测或纯化； ②Fc段介导的抗体效应功能，如ADCC、激活补体及调理作用等； ③延长该蛋白在血液中的半衰期。如“CD4免疫黏附素”。 抗体融合蛋白通过改造抗体的恒定区，使抗体的一部分被具有其他特性的非抗体序列替代。如Neubergor等将DNA聚合酶Ⅰ、Klenow活性酶、金黄色葡萄球菌核酸酶替换抗体的恒定区，使抗体既有与抗原特异性结合的性能，又具备了核酸酶的活性。 免疫毒素即单克隆抗体与毒素的偶联物，它与双功能性抗体有点类似，通过抗体原有的结合位点定位肿瘤部位，然后通过毒力非常强大的细菌或植物毒素来杀死肿瘤细胞。 ? 抗体库技术 抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。 噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术的产生依赖于三项实验技术发展： 一是简并引物的设计成功及从杂交瘤细胞中扩增出全套抗体可变区基因的PCR技术的创建； 二是从大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段的成功。 三是噬菌体表面展示技术的建立。 主导思想——将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体表达载体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。 抗体库技术以细菌克隆B细胞克隆，利用基因工程的方法，将全套人抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过宿主大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，并经过筛选后获得特异性的抗体。这类抗体可以是完全人源化的抗体。 噬菌体展示技术原理 噬菌体展示抗体库 噬菌体展示技术最早报道于1985年，它将外源蛋白与丝状噬菌体外壳蛋白融合，使外源蛋白表达在噬菌体颗粒表面。 其原理是将编码外壳蛋白的基因Ⅷ和基因Ⅲ与抗体基因融合表达，使表达的抗体附着在噬菌体表面，达到展示的目的，同时确保了抗体这一特定分子的基因型和表型在同一噬菌体颗粒内，即噬菌体核心DNA中含有特定蛋白分子的结构基因，并能在噬菌体表面表达该蛋白。 构建噬菌体抗体库过程： ①从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B细胞，提取mRNA并反转录为cDNA； ②应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的抗体基因片段； ③构建噬菌体载体； ④用表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲和吸附（结合）-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。 噬菌体展示技术 综上，基因型和表型的统一使噬菌体颗粒可以作为筛选特异性抗体的介质使用；而丝状噬菌体感染大肠杆菌并可大量扩增的能力又使这种特殊的介质具有可扩增性，即先通过筛选试验从数目庞大的噬菌体群中获得与目的抗原特异性结合的有限的噬菌体颗粒，然后再由感染大肠杆菌使筛选所得的有限噬菌体颗粒获得数量上的扩增，反复几次后便可获得能与目的抗原特异性结合的大量噬菌体颗粒，这也就是噬菌体展示技术筛选抗体的原理。 转基因动物表达抗体 Replace murine immunoglobulin (Ig)G genes with human IgG genes Weiner LM. J Immunother. 2006;29:1-9. Yan