复旦大学《生物制药技术》教学-动物细胞工程制药201511.pptVIP

猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒40的缩写，多瘤病毒科，这是在人类和猴子都发现的致瘤病毒 * * 胚泡：桑椹胚的细胞在子宫腔内继续分裂，细胞数目不断增多，发育到第5天时已有100多个细胞，这时细胞重新排列成泡状，称胚泡或囊胚。 * * 反转录病毒感染法的优点是： ①重组反转录病毒可同时感染大量胚胎； ②感染后的整合率高，可达100 %； ③不需要昂贵的显微注射设备； ④病毒以单拷贝形式插入整合位点，整合点宿主DNA 片段易于被分离纯化，有利于对插入位点的宿主基因进行鉴定。 缺点 ①外源基因难以植入生殖系统，成功率较低； ②反转录病毒载体容量有限，病毒衣壳大小有限，不能插入大的外源DNA片段（只能转移DNA≤10kb 小片段），因此，转入的基因很容易缺少其邻近的调控序列。 4）精子载体法 是将精子细胞灭能，即破坏细胞膜，然后与带有 外源基因的载体DNA混合培养，外源基因可直接 进入精子头部，将精子直接注射入卵细胞，经过 人工授精的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育 获得转基因动物个体。 Lavitrano 等于1989年首次报道使用小鼠附睾精子携带外源DNA受精，生产出表达外源基因的转基因小鼠。 该方法是将外源基因与精子共同培养，再通过电穿孔或脂质体介导等方法将外源基因导入成熟的精子，使精子携带外源DNA进入卵中并受精，从而使外源DNA 整合到染色体中。 精子载体法 DNA 精子 受精卵 卵细胞 共育法 脂质体转染法 电穿孔法 转基因动物 精子载体法特点 优点：利用精子的自然属性，克服了人为机械操作给胚胎造成的损伤，整合率高，小鼠、家兔达30％以上，成本低。 缺点是结果不稳定，目前具体的方法体系虽然还不完善，但它是有发展前途的方法。 它可以与体外受精、早期胚胎阳性选择和胚胎超低温技术相结合，使转基因技术更加实用化。 DNA 精子 受精卵 DNA 卵细胞 微注射 DNA 胚胎干细胞 DNA 逆转录病毒感染 磷酸钙-DNA共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物 微注射 常用转基因方法及其与受精卵不同发育阶段关系 5）基因打靶法 根据同源重组的原理实现了导入的外源基因的定点整合，这一技术即称为基因打靶（gene targeting）。 基因敲除 (gene knockout): 将某个基因定向去除 基因敲入 (gene knockin): 定向将一段基因序列替代另一段基因序列 同源重组 双链DNA的两个区段的DNA序列基本一致，但不一定完全相同，叫做同源区。同源的双链DNA可以通过相互交换进行重组。 外源DNA如有同源区，也可通过类似的同源重组过程整合到生物的染色体基因组上。 * * 基因敲除的基本程序 打靶载体的构建 打靶载体导入ES细胞：重组置换 基因敲除ES细胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宫中 嵌合体的杂交育种 2. 打靶载体导入ES细胞 磷酸钙-DNA共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法 脂质体包埋法 显微注射法 3. 基因敲除ES细胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宫中 5. 嵌合体的杂交育种 基因打靶的必备条件 胚胎干细胞(ES细胞) 能在体外培养，保留发育的全能性 打靶载体 Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase) - 两个同源DNA片段（HB1,HB2），它们与ES细胞中某一非必需基因两端同源，保证转基因及标记基因neor通过同源交换定向整合在ES的这一非必需基因内部。 - 转基因（TG），必须能赋予受体ES细胞新的功能。 打靶载体的构建 同源基因片段 质粒载体 neor基因 HSV-tk基因 HB1 HB2 同源重组整合, neo基因置换ES细胞基因组的目的基因 tk1 HB1 neor HB2 tk2 非特异整合 正负选择法: neor: 新霉素抗性基因, G418 ； tk-:丙氧鸟苷筛选 tk:单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶, 自杀基因, GCV 特异整合 tk1 HB1 neor HB2 tk2 ner Neo-/tk-:无外源基因整合，在G418中死亡； Neo+/tk+:随机整合，在GANC中死亡； Neo+/tk-:同源重组，在G418和GANC中存活； 三种结局： PCR鉴定 tk1 HB1 neor HB2 tk2 P1 P2 PCR 无条带 非特异整合 P1 PCR 特异条带 P2 CS HB1 neor HB2 特异整合 细胞核移植 * * 7、CRISP/CAS9 * * CRISPR/Cas9防御过程（获得性免疫） 第一阶段：