复旦大学《生物制药技术》教学-基因工程1.pptVIP

基因工程的宿主细胞 原核：细菌：大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌等 真核：酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等 第四节 目的基因的制备 生物合成基因未知 基因文库组构建 cDNA 文库 生物合成基因已知(GeneBank可查) 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 逆转录PCR（retrotranscription PCR， RT－PCR） 化学合成 一、寻找目的基因 1 基因组文库（genomic DNA library）： 是指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片断随即的同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列，包括外显子和内含子序列 。 基因组文库应用： 1）原核生物目的基因的分离（目的基因在质粒上） 提取质粒DNA→限制性酶切→从DNA凝胶电泳回收不同大小的片段→与载体连接构建物理图谱→探针杂交→分离目的基因。 2 ）鸟枪法分离基因（目的基因在染色体DNA上）： 用限制性内切酶将染色体DNA酶切，得到很多同一般基因大小相当的DNA片断，然后将这些片断混合物随即重组入适当的载体，转化后在受体菌种扩增，再用适当的方法筛选出需要的基因： 2 真核生物基因组文库--（cDNA文库） （含内含子） cDNA文库（cDNA library）建立： 从真核细胞分离总RNA,纯化出mRNA,逆转录合成互补的DNA,再在聚合酶作用下合成cDNA第二条链,然后将双链cDNA插入到载体内,构建重组体,转入宿主菌,得到的克隆总和成为该类细胞的cDNA文库. cDNA文库特征： 包含成熟mRNA的全部信息,即包含该细胞内表达的全 部蛋白的编码信息. 它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被 转录成 mRNA的那些基因序列。其复杂性比基因组文库低。 由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达的所决定的，因此各自的mRNA的种类就不同，由此而产生独特的cDNA文库。 二.制备目的基因 （一）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 1 基本原理 :根据碱基配对原则利用DNA聚合酶催化和dNTP的参与下，引物依赖于DNA模板特性引导DNA的合成。 变性（denaturation）：94℃ 3-5min. 退火（annealing）：55-60℃，1min左右。 延伸（extension）：72℃，1min. 从引物的3’-OH进行延伸，合成方向为5’-3’,从而合成2分子与原来基因相互补的片段，每循环一次，DNA分子按指数倍增。一般可得到100bp-5000bp的目的基因。 1??????? PCR反应要点 1）模板 DNA模板：0.05-1ug，含单拷贝基因数3*105， RNA模板：RNA→cDNA 2）????DNA聚合酶 ? Taq DNA聚合酶：耐高热，粘末端产物 Pfu DNA聚合酶：高保真酶。平末端产物 3）缓冲系统： 4）dNTP浓度： 5）引物设计原则： 2 PCR应用 基因结构的研究：基因组制图预测序；分子杂交探针；DNA定型；PCR直接测序；利用免疫PCR检测抗原和抗体。 基因表达与调控研究：mRNA检测；调控元件分析；蛋白质和DNA相互作用的研究。 基因工程上构建5‘端内切酶接头，构建cDNA文库。 医学上用于遗传及传染性疾病的基因诊断。 制药中筛选抗肿瘤抗生素。 鉴别菌株 （二） 逆转录PCR（retrotranscription PCR， RT－PCR） mRNA的纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 1 mRNA的特征及纯化 含量低，占总RNA的1-3%,大小不均。 3’端含50-250个poliA（多聚腺嘌呤核苷酸） 纯化利用Oligo（dt)固定相（生物素化寡脱氧胸腺核苷酸）。 总RNA流经固定相，mRNA吸附于固定相上，tRNA和rRNA流出。 洗脱，收集mRNA。 寡聚Oligo(dt)吸附在纤维素柱 mRNA-dT杂交体 洗脱 mRNA 模板 Oligo(dT) 逆转录酶 mRNA cDNA第一链 Rnase,DNA poli I SI核酸酶 cDNA 总RNA（高盐） （三）、DNA化学合成 一般DNA合成都采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶联等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。 DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5‘→3’方向延伸，而是由3‘端开始。具体的反应步骤如下： 1 脱保护基(Deblocking) ：脱去核苷酸的保护基团DMT，获得游离