复旦大学《生物制药技术》教学-制药技术讲义.docxVIP

分离纯化酶的一般程序粗酶液的制备：材料的选择，发酵液处理，细胞破碎及酶的抽提酶的初步分离：盐析，等电点沉淀，有机溶剂沉淀，离心分离酶的高度纯化（酶的精制）：层析法（凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析），电泳（等电聚焦电泳）浓缩干燥及结晶：透析，旋转蒸发，超滤，冷冻干燥粗酶液的制备1、细胞破碎（机械、物理、化学、酶解）2、酶的抽提（酸碱、盐溶液、有机溶剂）酶的主要分离技术1离心分离2沉淀分离（等电点沉淀法，盐析法，有机溶剂法）3膜分离（超滤，透析）酶的主要纯化技术－层析技术离子交换层析ion exchange chromatography凝胶过滤层析gel filtration疏水层析hydrophobic chromatography亲和层析affinity chromatography区别离子带不同电荷的蛋白质与固定相的吸附洗脱能力不同凝胶分子大小，相对分子量疏水蛋白的疏水集团与固定相的疏水配基吸附能力不同亲和根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的方法凝胶层析的原理凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；生物传感器的概念由生物识别物质（如酶、微生物、动植物组织、抗体等）和能量转换器相结合所构成的分析仪器，可以简便快速的测定各种特异性很强的物质生物传感器的一般结构与工作原理结构:有两个部分组成1生物分子识别元件（感受器）：酶、核酸、抗体、细胞等2信号转换器（换能器）：电化学电极、光学检测元件、热敏电阻、表面等离子共振器件等工作原理：待测物质经扩散作用进入生物传感器,通过分子识别发生特异的生物化学反应,产生的生化信号经换能器转换为可定量和可处理的电信号,进而可检测出该物质的浓度酶工程在医疗上的应用药用酶:消化酶类,抗炎症类,心血管类,肿瘤用酶例淀粉酶。脂肪酶来源麦芽微生物，消化不良食欲不振疾病诊断:酶活检测; 分析试剂固定化酶制备药物:抗生素,氨基酸改型抗体（reshaped antibody，RAb）亦叫“重构抗体”，“CDR移植抗体（CDR grafting antibody）”。它是利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补性决定区（complementarity determinative region，CDR）的氨基酸序列改换成鼠源单抗CDR 序列。特点：此种抗体可以使人单抗获得鼠单抗的特异性又保持人源抗体的亲和力改型抗体特点：比嵌合抗体人源性程度高，但亲和力常常偏低。嵌合抗体（chimeric antibody）特点:是用人抗体的C区替代鼠的C区。效果:使鼠源性单抗的免疫原性明显减弱，并可延长其在体内的半衰期及改善药物的动力学。属第一代人源化抗体（humanized antibody，HAb）嵌合抗体的基本原理是从分泌某种鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性鼠IgV区基因，经基因重组与人IgC区基因按一定方式相拼接，克隆到表达载体中构建鼠/人嵌合的轻重链基因表达载体，并转入适当的宿主细胞表达,制备特异性嵌合抗体单克隆抗体的制备基因工程抗体的制备基因工程抗体技术的基本操作是首先从杂交瘤或免疫脾细胞外周血、淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中，并在适当的宿主细胞如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或转基因动物和植物中表达，并折叠成有功能的抗体分子，筛选出高表达细胞株，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。HAT筛选原理HAT培养基 H, Hypoxanthin次黄嘌呤; A, Aminopterin氨基喋呤 T, Thymidine胸腺嘧啶核苷由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基蝶呤阻断，瘤瘤融合细胞和未融合瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾脾融合细胞B淋巴细胞在这样的组织培养条件下不能长期生长，几天内迅速死亡。由于骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺乏株，脾细胞内却又这种酶，融合细胞可利用HGPRT酶，用次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成DNA，并能克服氨基蝶呤的阻断，使杂交瘤细胞正常生长，大量繁殖被筛选出来。人单克隆抗体