复旦大学《生物制药技术》教学-酶工程201511.pptVIP

酶传感器的工作原理: 待测物质经扩散作用进入生物传感器,通过分子识 别发生特异的生物化学反应,产生的生化信号经换 能器转换为可定量和可处理的电信号,进而可检测 出该物质的浓度. 根据反应产生的信号不同，可选择相应的换能器. 生物传感器的工作原理 二、酶传感器的类型 酶电极（电位型、电流型） 热敏电阻酶传感器 离子敏场效应晶体管酶传感器 光纤酶传感器 思考题： 1、酶的基本概念、特点，分类 2、分离纯化酶的一般程序 3、酶分离纯化的注意要点 4、细胞破碎的方法，酶抽提的方法 5、透析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析的原理 5、固定化酶（细胞）的概念及优缺点 6、固定化酶的制备方法，及各种方法的特点和优缺点 7、生物传感器的概念、一般结构和基本工作原理 8、举例说明酶工程在制药工业中的应用。 重点参考/link?url=6SoKIc-iKsunEuKNgcSNa0QVFFw8EgOF-U8vW9enLH43XU3YY5Hb1chEbjCSqA0Jqcps11kPPlVjm1OT5wFbkfdjg95ED2bLVOaSw7_b_3u * 胃液中有凝乳酶,能使乳中蛋白质凝聚成乳酪 * * * 流动相极性大于固定相极性的情况，称为反相色谱。色谱聚焦（chromatofocusing）：是一种高分辨率的新型的蛋白质纯化技术。 这是根据蛋白质的等电点，结合离子交换技术的大容量色谱，能分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被聚焦效应浓缩，峰宽度可达0.04~0.05PH单位，分辨率很高，操作简单，不需特殊的操作装置。 本法适用任何水溶性的两性分子，如蛋白质、酶、多肽、核酸等。 * * 极性大小可以看分子或基团的对称性。对称性越强极性越小，疏水性较大。反之极性小，疏水性弱。 * * FPLC全称为快速蛋白液相色谱（Fast protein liquid chromatography），其原理与高效液相色谱理论类似，是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并且对相体进行了改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱。 * 酶的氨基、硫基，酚基 将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进活波的重氮集团。 载体活化后，活波的重氮集团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应而制的固定化酶。 * 两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱 * 亲和介质的制备1）配基的选择 2）载体的选择 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃 琼脂糖凝胶 纤维素 3）手臂（spacer arm） 载体本身没有活性基团，要先活化，引入手臂，再接配基 常使用ω-氨烷基化合物 四、酶的纯度鉴定技术 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) 凝胶制备：丙烯酰胺（Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合，催化体系有两种： 化学聚合：过硫酸铵（或过硫酸钾）＋N,N,N’,N’-四甲基已二胺（TEMED） 光聚合：核黄素，可加TEMED加速聚合 43 K 66.2 K 97.4 K 130 K 200 K M 1 2 3 4 5 6 M M：蛋白分子量标准 1：菌体破壁抽提液 2：硫酸铵沉淀 3：Q-sepharose层析洗脱液 4：phenyl-sepharose层析洗脱液 5：羟基磷灰石层析洗脱液 6：sepharyl S-300层析洗脱液 游离酶的缺点： 稳定性差、易失活。 不能重复使用，成本高。 不能与产物分离，酶反应后分离纯化困难。 酶的固定化技术通过各种方法（吸附、结合、包埋等）能够有效地对酶进行修饰，改善酶的化学稳定性，并可重复使用 第三节 酶与细胞的固定化 什么是固定化酶？ 水溶性酶 水不溶性载体 水不溶性酶 （固定化酶） 固定化技术 一、固定化酶（细胞）的定义 一、固定化酶（细胞）的定义 优点： 1.稳定性显著提高； 2.同一批固定化酶能重复多次地使用； 3.固定化后，很容易与反应物分开（过滤），不污 染产物，而且有利于控制生产过程，同时也省去了 热处理等使酶失活的步骤； 4.可长期使用，并可预测衰变的速度； 5.提供了研究酶动力学的良好模型。 缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活 二、酶固定化方法 载体结合法 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 交联法 包埋法 网格型 微囊型 酶固定化关键在于 选择合适的载体和适当的固定化方法 1、载体结合法 是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。 1）物理吸附法 作用方式：非特异性物理吸附作用：范德华力；氢键；疏水作用；静电作用 优点：制作简单，酶分子的构象很少或基