分子生物学（共计671页，共计2部分）_部分2.pptx

5.1 重组DNA技术发展史载体目的基因（外源基因）PCR产物质粒噬菌体病毒基因组DNA cDNA人工合成连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交重组DNA技术操作的主要步骤限制酶消化开环载体DNA目的基因5.1 重组DNA技术发展史5.1.5重组DNA技术的意义 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。 5.1 重组DNA技术发展史5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端末端转移酶在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶Ⅲ从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团5.1、 重组DNA技术发展史GCCTAGGGATCCCCTAGGGATCC G限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶 Bam HⅠ+分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）5.1 重组DNA技术发展史 属 系 株 序命名Hin dⅢHaemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。5.1 重组DNA技术发展史GGATCCCCTAGGⅡ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口 ：平端切口、粘端切口5.1 重组DNA技术发展史GTCGACCAGCTGGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GGTCCAGGACCTGHindⅡBam HⅠ++平端切口粘端切口5.1 重组DNA技术发展史DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片断连接成一个整体DNA分子。T4ˉDNA连接酶EcoR I 连接酶T7ˉDNA连接酶5.1 重组DNA技术发展史目的基因的来源天然DNA（染色体DNA、病毒DNA(噬菌体DNA)、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA） 原核细胞真核细胞：cDNA或gDNA文库人工合成及PCR扩增目的基因 5.1 重组DNA技术发展史（八）重组实验中的主要载体定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。5.1 重组DNA技术发展史克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。5.1 重组DNA技术发展史载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。5.1 重组DNA技术发展史噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5′端突出粘性末端 λ噬菌体黏粒、YAC、BAC ：高容量载体5.1 重组DNA技术发展史个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小质粒：10kbλ噬菌体：23kb黏粒：45kbBAC：350kbYAC：1000kb5.1 重组DNA技术发展史 以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程5.2 常见的DNA操作技术5.2.1 细菌转化转化（transformation） ：P151将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状转导？ 转染？ 感受态细胞（Competent cells） ：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于这种状态下的细胞称~5.2 常见的DNA操作技术常用的转化方法：化学转化（CaCl2）法电击法5.2 常见的DNA操作技术 化学转化原理： 在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆 菌细胞膨胀成球形