2011酶的提取纯化和酶促反应动力学.pptVIP

实验内容 实验一 小麦胚芽中酸性磷酸酶的提取纯化（8学时） 1 分离纯化小麦胚芽中酸性磷酸酶 2 酶蛋白含量测定及比活性分析 实验二 酸性磷酸酶动力学性质的研究（8学时） 1 酸性磷酸酶时间进程曲线 2 酸性磷酸酶酶浓度-速度曲线 3 pH-酸性磷酸酶活性曲线 4 酸性磷酸酶米氏常数的测定 5 磷酸盐对酸性磷酸酶活性的抑制作用 酶（enzyme）是由活细胞合成的,对其特异底物起高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的生物催化剂(biocatalyst) 绝大多数的酶是蛋白质，称为酶（enzyme） 具有催化功能的RNA被称为核酶(ribozyme) 具有催化功能的DNA被称为脱氧核酶(deoxyribozyme) 底物：Subestrate：S 产物：Product：P 酶：Enzyme：E （一）化学本质：除（ribozyme）是蛋白质 （二）高效催化性 （三）高度特异性 （四）可调节性 （五）不稳定性 绝对特异性(absolute specificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物 。 相对特异性(relative specificity)：作用于一类化合物或一种化学键。 立体结构特异性(stereo specificity)：作用于立体异构体中的一种。 酸性磷酸酶是一组底物特异性较低的酶，因底物不同，测定方法很多。具有代表性的方法有： （1）以布氏（Bodansky）法为代表：β-甘油磷酸钠做底物 （2）以金-阿（King-Armstrong）法为代表：磷酸苯二钠做底物 （3）以皮-劳（Bessey-Lowery-Brock）法为代表：人工合成底物磷酸对硝基酚二钠盐（PNPP）做底物 对酶生成与降解量的调节 酶催化效力的调节 通过改变底物浓度对酶进行调节等 广义上讲:多酶体系、关键酶、限速酶 酶促反应是在温和条件下进行 加热、过酸、过碱、重金属都可以使酶活性降低（失活） 器材洁净 纯净水 试剂纯度高 动作温柔 －减少泡沫 选择合适的缓冲体系 添加物 降温措施－冰水浴 概念： 研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述 意义： 最适条件－酶量最少、催化效率最高 酶浓度 底物浓度 pH 温度 反应时间 抑制剂 激活剂 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程 1.反应速度：酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示。V=-d[P]/dt=d[S]/dt 2.初速度(initial velocity)指在反应最初阶段底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度，用v0来表示。 3..最大反应速度(maximum velocity)是指当酶的结合位点与底物结合饱和时的反应速度，通常用V或Vmax来表示。 4.米氏常数（Michaelis constant，Km）是指酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位同底物浓度 （一）底物浓度对反应速度的影响 酸性磷酸酶米氏常数的测定 （二）酶浓度对反应速度的影响 酸性磷酸酶酶浓度-速度曲线 （三）时间对反应速度的影响 酸性磷酸酶时间进程曲线 （四） pH对反应速度的影响 pH-酸性磷酸酶活性曲线 （五）抑制剂对反应速度的影响 磷酸盐对酸性磷酸酶活性的抑制作用 当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。 关系式为：V = K3 [E] 双重影响 温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。 酶的抑制剂(inhibitor) 凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。 *可逆性抑制概念 抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。 竞争性抑制作用定义 抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。 激活剂(activator) 使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。 ? 必需激活剂 (essential activator) ? 非必需激活剂 (non-essential activator