细胞融合(2010-2011-2).pptVIP

细 胞 融 合 实验目的 1.了解并掌握细胞融合的方法 2.了解细胞融合技术及其在生命科学中所起的作用 3.掌握化学融合法，了解电融合法及CRY-3细胞融合仪的使用 细胞融合技术的发展 原生质体融合细胞的再生愈 利用细胞融合技术观察蛋白质运动 实 验 原 理 电融合所用的细胞融合仪 实验用品 实验材料：成年公鸡 实验器材：离心机，EP管，微量取样器，吸管，水浴锅，载玻片，盖玻片，显微镜 Alsever溶液、GKN溶液、0.85％生理盐水、50％PEG溶液，双蒸水 实 验 流 程 实 验 操 作 在公鸡翼下静脉抽取2ml鸡血，加入盛有8ml的Alsever液中，使血液与Alsever液的的比例达1∶4，混匀后可在冰箱中存放一周； 取此储存鸡血0.2ml加入0.8ml的0.85％生理盐水，充分混匀，1000r/min离心5min，弃去上清，加入1ml的0.85％生理盐水，重复上述条件离心两次。最后弃去上清，加GKN液1ml，离心； 弃去上清，加入1ml的GKN溶液，制成细胞悬液；（也可以用血球计数板计数，用GKN液将其调整为106个/ml）； 实 验 操 作 取以上细胞悬液0.1ml放入1ml的EP管中，然后再加入0.1ml的GKN液，放入37℃水浴中预热，同时将50％PEG液一并预热20min； 20min后将0.2ml的50％PEG溶液逐滴沿离心管壁加入到0.2ml细胞悬液中，边加边摇匀，然后放入37℃水浴中保温20min； 20min后，加入GKN溶液1ml，静止于水浴中20min左右； 1000r/min离心5min，弃去上清，加GKN溶液再离心1次； 弃去上清，加入GKN液少许，混匀，取少量悬浮于载玻片上，加入詹纳斯绿染液，用牙签混匀，3min盖上盖玻片，观察细胞融合情况。 融 合 过 程 融 合 过 程 相关实验溶液的配制 Alsever溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl 0.42g，溶于100ml双蒸水中。 GKN溶液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·2H2O 1.77g，NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于1000ml水中。 50％PEG溶液：称取一定量的PEG（WM＝4000）放入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至50℃时，加入等体积预热至50℃的GKN溶液，混匀，置37备用。 * * * * 两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。 诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。 1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。 2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。 3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 细胞融合技术在基因定位、基因表达产物、肿瘤诊断核治疗、生物新品种培育及单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。 鸡血细胞收集 鸡血细胞悬液制备 PEG诱导细胞融合鸡血细胞收集 终止PEG反应 细胞悬液制备 染色 镜检 瞧，我们三个融合了 * *