实验一 真核生物基因组DNA的提取和分析-2014.924.ppt

【操作步骤】 基因组DNA的提取 1．组织细胞的裂解 （1）切取0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次。当组织离开机体，DNA酶就会表现出活性。在冰冷的生理盐水中，可以降低DNA酶的活性，防止基因组DNA被降解。 （2）碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL分离缓冲液，匀浆（冰上操作）。 （3）匀浆液转入2mL离心管，4℃ , 5000rpm离心5min；沉淀加0.4mL无菌水，吹散后再加0.4mL的蛋白酶消化液（含100μg/ml的蛋白酶K），慢慢颠倒混匀，50℃保温90分钟, 直到组织完全解体。 （4）加10mg/ml的RNase 16μl (终浓度200μg/ml)，37℃保温40min。 2．裂解物中蛋白质的去除 （1）加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，慢慢颠倒混匀，冰上静置5min。待分层后, 于4℃，12000rpm离心15min。离心后可见分层，上层为水相含DNA，下层为有机溶剂层，变性蛋白质介于两层之间。 （2）小心吸出上面的水层并转移到新的小离心管中，根据吸出的量再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，重复上述操作以去除蛋白质，直至界面不再出现明显的变性蛋白质为止。 （3）小心吸出上面的水层并转移到另一新的小离心管中，根据吸出的量再加入等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀。4℃，12000rpm离心15min。本步骤可去除微量的酚。 　3．DNA的沉淀 　1）上清加1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。10000rpm离心10min，弃上清。 　 　2）DNA沉淀溶解于3ml TE 中，进行260nm/280nm紫外检测。 核酸定性定量检测 核酸的含量可以用定磷法、定糖法和紫外分光光度法来测定。 定磷法是利用核酸分子中磷的含量相对恒定这一性质来测定核酸的含量，该法测定的结果较准确（RNA、DNA中磷的质量分数的平均值分别为9.5%，9.9%）； 定糖法中的二苯胺法测定DNA的含量 紫外分光光度法测定核酸较为方便，但误差较大。 二苯胺显色法测定DNA含量 【基本原理】 DNA在酸性条件下加热，酸解释出脱氧核糖。脱氧核糖在酸性环境中脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595 nm处有最大吸收。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。 除脱氧核糖外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。 实验流程 实验流程 实验流程 DNA含量的计算 根据测得的光吸收值，绘制标准曲线，从标准曲线上查出相当该光吸收值的DNA的含量。 紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度 【基本原理】 1．紫外分光光度法测定核酸含量： 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50μg /ml双链DNA。 　2．紫外分光光度法测定DNA纯度： 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，而蛋白质在280nm处有最大的吸收峰。 DNA纯品的A260/ A280为1.8（1.7~1.9），故根据算A260/ A280的值可以估计DNA的纯度。 若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。 【操作步骤】 1．用TE缓冲液稀释样品（5～20倍）， 2．用TE缓冲液调零点，样品稀释液转入紫外分光光度计的石英比色杯中，分别测定其在260nm和280nm的吸光度。吸光度在0.2～1.2 OD范围内较为理想。 3．计算浓度： 双链DNA样品浓度(μg/μl) =A260×核酸稀释倍数× 50/1000 4．计算A260/ A280比值，分析纯度。 * * 实验室规则 （一）保持实验室安静，认真仔细地按实验指导进行实验。 （二）穿戴好实验服。保持实验台的清洁整齐。 （三）爱护仪器，谨慎使用。节约使用药品试剂，蒸馏水，自来水和电。 （四）不得将高温、强酸强碱、有毒污垢物品抛洒在实验台上。 （五）公用物品用毕放回原处，不得私自占有。 （六）取完试剂应将瓶盖盖好，切勿错盖，用毕放回原处。 （七）加热、用电，使用剧毒腐蚀试剂应注意安全操作，避免事故。 （八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应倒入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。动物尸体应放入指定的容器中。 （九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时向指导教师反映取得帮助。 （十）实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公用物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指导教师检查，允许后方可离开。 实验报告 实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照下列顺序写出实验报告： 实验报告首页：