表皮生长因子受体信号通路人子宫内膜癌移植瘤孕激素耐药机制中的作用-妇产科学专业论文 word格式.docxVIP

第一部分人子宫内膜癌皮下移植瘤孕激素耐药模型的建立及其生物学特性的研究以裸鼠为载体建立的各种人类肿瘤模型是研究肿瘤生物学性状和诊疗方法的重要工具，随着对肿瘤微环境的深入研究，学者们发现，将人癌细胞悬液或组织学完整的人癌组织移植至受体动物体内，形成皮下或原位移植瘤模型将能更客观地模拟肿瘤在人体内的浸润及转移特性[30]。在本部分实验中，我们拟建立子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤孕激素耐药模型，并对其生物学特性进行检测，为进一步研究人子宫内膜癌孕激素耐药机制的体内实验和临床研究奠定基础。1.材料与方法材料1.1.1细胞株及动物来源(1)细胞株来源：人子宫内膜癌孕激素敏感型细胞株Ishikawa由广州中山大学附属第三医院惠赠，为分化较好，ER、PR呈阳性表达，EGFR呈低表达的细胞株[31]；人子宫内膜癌孕激素不敏感型细胞株Ishikawa-pLWERNL是一转染了携带EGFR基因的pLWERNL质粒的细胞株，为本实验小组于2008年建立的一Ishikawa细胞亚系，为PR-B 呈低表达，EGFR呈稳定过表达的细胞株[28]。(2)动物来源：BALB/c（nu/nu）纯系裸鼠，雌性，4~6周龄，体质量16~18g，由中国科学院上海实验动物中心提供，动物生产许可证号码为SCXK（沪）2007-0005，使用许可证号码为SYXK（沪）2006-0010。1.1.2主要试剂及耗材(1) 细胞培养用胎牛血清（杭州四季青公司）DMEM-F12培养基（Hyclone，USA）胰蛋白酶（Gibco，USA）G418（Gibco，USA）(5) HEPES（上海润城生物科技有限公司）75cm2培养瓶（Corning，USA）0.22μm一次性滤器（Millipore，Switzerland）Eppendorf管（Axygen，USA）(9) 血球计数板（上海求精生化制剂仪器有限公司）(10)1mL注射器（山东威高集团医用高分子制品股份有限公司）(11)无菌隔离衣（上海六谷科技发展有限公司）(12)一次性口罩、帽子（吴江亿成医疗器械有限公司）(13)无菌橡胶手套（上海华新医材有限公司）(14)二甲苯（北京化学试剂公司）(15)无水乙醇（北京化学试剂公司）(16)改良型苏木素（北京康为世纪生物科技有限公司）(17)中性树胶（北京康为世纪生物科技有限公司）(18)伊红Y染色液（北京康为世纪生物科技有限公司）1.1.3主要仪器设备(1)恒温CO2培养箱（TheromHERAce11150，USA）(2)超净工作台（苏州净化设备有限公司）(3)低速离心机TDL-40B（上海安亭科学仪器厂）(4)精密天平（上海精密科学仪器有限公司）倒置相差显微镜（Olympus，Japan）倒置显微镜及显微成像系统（Olympus，Japan）(7)恒温水槽（上海精宏试验设备有限公司）纯净水机（Millipore，Switzerland）微量加样器（Eppendorf，Germany）(10)蜗旋器QL-901（江苏海门市麒麟医用仪器厂）(11)蒸汽高压灭菌锅（BiocareDC2002）1.1.4试剂的配置及用法(1) 100mMHEPES缓冲液精密天平称取2.38gHEPES粉溶于80mL无菌蒸馏水中，用NaOH调pH值到7.5，补水至100mL，置于4℃冰箱避光备用。(2) G418 液称取1gG418溶于7.25mL100mMHEPES缓冲液中，即成终浓度为100mg/mL的G418。用0.22μm一次性滤器过滤除菌，分装于灭菌Eppendorf管中，置于-20℃冰箱备用。用前稀释呈所需浓度。方法1.2.1细胞培养及细胞悬液的制备(1) 细胞培养：人子宫内膜癌孕激素敏感型细胞株Ishikawa及孕激素不敏感型细胞株Ishikawa-pLWERNL采用10%胎牛血清、DMEM-F12培养基置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养；Ishikawa-pLWERNL细胞在培养基中另600μg/mLG418维持筛选。细胞呈贴壁生长，3~4d传代一次，见图1。取对数生长期细胞用于肿瘤接种。A：Ishikawa细胞；B：Ishikawa-pLWERNL细胞放大倍数：×100图1.Ishikawa与Ishikawa-pLWERNL细胞镜下结构和形态Figure1.CellstructureandmorphologyofIshikawaandIshikawa-pLWERNLundermicroscope(2)细胞悬液的制备：取对数生长期细胞，经胰酶消化后用血球计数板进行计数；以1000r/分，4℃条件下离心5min，弃上清液，用PBS再次洗涤离心细胞2 次，各5min，最后用PBS再次重悬细胞，并用移液枪将细胞悬液分装至无菌的Eppendorf管中，冰浴保温备用。1.2.2动物饲养及肿瘤模型的