表观遗传修饰增加两株浒苔真菌的化学多样性研究-药物化学专业论文 word格式.docx

IV表观遗传修饰增加两株浒苔真菌的化学多样性研究摘要表观遗传修饰学是研究DNA序列没有发生变化的可遗传的基因表达的改变。近年发现，真核生物的组蛋白乙酰化、DNA去甲基化和染色质去压缩状态可促进基因活化、提高基因转录子的启动。因此这种思路被引用到真核微生物真菌沉默基因的激活和基因表达上。为了激活海洋真菌沉默基因的表达，从其发酵液中发现新的具有生物活性的次生代谢产物，本论文对31株分自青岛海域浒苔样品的真菌进行了筛选，对每株菌株采用DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂进行调节，并对其发酵后得到的萃取物使用TLC/HPLC化学筛选与抗肿瘤生物活性筛选相结合的组合生物学筛选模式进行筛选。最终筛选出代谢产物种类变化丰富生物活性显著提高的2 株菌株进行进一步的研究。通过添加DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂筛选出代谢产物种类变化丰富生物活性显著提高的2 株菌株进行发酵，并分别在自然条件下发酵该两株菌株，分别萃取获得4份发酵产物。利用常规加压/减压硅胶柱色谱、凝胶柱色谱以及HPLC高效液相色谱法等分离手段分别对发酵萃取物进行化合物的分离纯化及鉴定，共获得41 个单体化合物（Fig. 0-1）。综合利用红外光谱（IR）、紫外光谱（UV）、质谱（MS）、核磁（NMR）、比旋光（OR）、圆二色谱（CD）等方法确定了化合物的结构。其中从菌株Aspergillusterreus OUCMDZ-2739不添加抑制剂培养条件下分离鉴定化合物7 个（1–7），均为已知化合物。从其添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）调节的发酵萃取物中分离得到差异化合物18 个（8–25），其中新化合物9 个，差异类型化合物5类。从菌株Penicilliumsp.OUCMDZ-770不添加抑制剂培养条件下分离鉴定化合物8 个（26–33），新化合物2 个。从其添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠（VPA）调节的发酵萃取物中分离得到差异化合物8 个（34–41），其中新化合物1 个，差异类型化合物4 类。对从AspergillusterreusOUCMDZ-2739中所分离鉴定的化合物进行了常见致病菌的抑菌活性测试和对多种肿瘤细胞的细胞毒活性测试。结果表明：化合物8、12、21对大肠杆菌有弱的抑制活性，MIC分别为25μg/mL、50μg/mL、50μg/mL。对从Penicilliumsp.OUCMDZ-770中所分离鉴定的化合物进行了常见致病菌的抑菌活性测试和对多种肿瘤细胞的细胞毒活性测试。结果表明：化合物30、32、41对A549细胞有弱的抑制活性，IC50分别为18 μM、21μM、28μM。化合物36、41对Enterobacteraerogenes（产气杆菌）表现出弱的抑制活性，MIC分V别为50、30μg/mL。海洋真菌微生物在常规实验室培养条件下由高压、高盐、低温、寡营养这些其独特的生存环境导致其截然不同于陆生微生物的代谢途径常处于抑制状态而不能表达。本论文通过实验证明利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA、TSA调节，可有效激活海洋真菌实验室培养条件下沉默基因的表达，进而表现出其独特的代谢途径，产生结构新颖种类不同于常规培养条件下的代谢产物。本文研究内容主要包括以下3 个方面：1. 目标菌株的筛选。对采自于青岛海域的浒苔样品中分离纯化获得的31 株浒苔共附生真菌进行表观遗传修饰的调控，针对每株真菌分别使用DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂进行调控，对每份发酵萃取物采用TLC薄层色谱和HPLC指纹图谱作为化学检测手段，并以抑菌试验、MCF-7肿瘤细胞增殖抑制等手段作为生物活性筛选模型，以化学和生物活性评价相结合的集成筛选模式，筛选代谢产物种类多样性变化丰富、生物活性显著提高的菌株作为目标菌株，最终通过集成筛选获得2 株菌株作为研究目标。2. 表观遗传修饰调控对两株浒苔来源真菌次生代谢产物影响的研究。对次生代谢产物变化丰富生物活性显著提高的2 株浒苔来源真菌分别进行不添加抑制剂培养条件和添加抑制剂进行调节的发酵条件进行规模发酵，分别对4 份发酵萃取物进行分离鉴定，通过对比得到表观遗传修饰策略高效性的结论。通过TLC薄层色谱、正相/反相/加压/减压硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱、HPLC反相高效液相色谱等实验室常规分离方法，从不添加抑制剂培养条件和添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂的培养条件下的发酵萃取物中共分离得到41个单体化合物；应用紫外光谱UV，红外光谱IR，核磁共振波谱NMR，质谱MS等波谱解析技术鉴定了41 个单体化合物的化学结构（Fig. 0-1），其中新化合物12 个。从菌株AspergillusterreusOUCMDZ-2739不添加抑制剂培养条件下分离鉴定化合物7个（1–7），均为已知化合物，包含五个二