井冈霉素高产的比较功能基因组研究-微生物学专业论文 word格式.docx

井冈霉素高产的比较功能基因组研究摘 要井冈霉素是我国自主开发、应用面积最广、产业化最为成功的农用抗生素之 一，主要用于防治水稻纹枯病，同时也是糖尿病治疗药物伏格列波糖合成的重要 前体，具有较高的产品附加值。井冈霉素产生菌吸水链霉菌井冈变种是上世纪 70 年代由沈寅初院士从井冈山地区分离到的，其正常生长温度为 30℃，但在发 酵温度为 37℃时，产量有大幅度提高。在摇瓶发酵条件下，实验室菌株 5008 的 产量约为 2 克/升，经过四十年的传统诱变育种，其衍生的工业菌株 TL01 产量达 到 18 克/升，在工厂发酵罐中甚至高达 30 克/升，发酵周期仅为 2 天。因此，该 类菌株具有产量高、发酵温度高和发酵周期短等优良特性，这为通过比较功能基 因组学研究揭示井冈霉素的高产机制提供了极佳的研究材料。本论文主要分为以 下四个部分。第一部分 井冈霉素产生菌 5008 基因组完整图谱的构建与解析利用 454 测序技术测定了菌株 5008 的基因组序列，使用各种文库（6-8 kb 质粒文库和 fosmid 文库）末端序列信息、数据分析与基本分子生物学实验进行 了草图中缺口的填补，并结合特殊的末端片段克隆方法识别了 5008 基因组的四个端粒，成功构建了 5008 基因组的完整图谱。除了大小为 10,145,833 bp 线型染 色体外，通过脉冲场电泳还发现了 164,566 bp 的线型质粒，同时结合大质粒提取 和电泳分析还确认了 73,285 bp 的环型质粒。链霉菌基因组的比较分析发现，5008 染色体有着相对较小的核心区（5.56Mb）、最短的末端反向重复序列（14 bp），并编码了更多（比例）的 α/β 水解酶、 MFS 转运蛋白和镁离子/锰离子依赖的磷酸酶。还编码了 29 个聚酮（PKS）、非 核糖体肽类（NRPS）、杂合聚酮-多肽（PKS-NRPS）、萜类（terpene）、硫肽类（lantibiotic）等次级代谢产物，其中只有井冈霉素和环噻唑霉素合成基因簇得到 确认。另外，我们重建了井冈霉素合成前体相关的初级代谢通路，碳源前体为I7-磷酸景天庚酮糖和 UDP-葡萄糖，氮源前体可能为谷氨酸。分析发现 5008 存在两个 UDP-葡萄糖合成酶的编码基因（ugp），用于提供糖基合成井冈霉素，而其 它已测序的链霉菌只编码一个 ugp。第二部分 井冈霉素生物合成温度调控的转录组研究 通过基因组芯片技术，我们分析了 5008 在 30℃与 37℃条件下的转录谱变化，在 37℃分别有 701 个上调和 841 个下调的差异表达基因。鉴于阿维链霉菌 NRRL8165 与 5008 有着更多的同源基因，且不存在抗生素合成的温度调控现象， 我们开展了在同样发酵条件下的 NRRL8165 转录组分析，在 37℃下分别有 422 个上调和 611 个下调的差异转录基因。除去共同的差异表达基因并在更严谨参数的筛选下，5008 分别有 122 个上调和 237 个下调的显著差异表达基因，其中氨 基酸转运和代谢、无机离子转运和代谢中具有更多的显著下调基因。在次级代谢中，除了糖基转移酶 ValG、转运蛋白 ValH 和双组份调控蛋白 ValPQ 外，井冈霉素基因簇中其它基因的转录水平有着 4-23 倍的显著上调，另 外还发现有 3 个次生代谢合成基因簇的整体转录水平发生显著上调。在初级代谢 中，第一，糖酵解中 6-磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和丙酮酸激酶基因的 转录水平略有下调，同时葡萄糖酸激酶和柠檬酸裂解酶显著上调，这暗示 37℃ 发酵条件下糖酵解和三羧酸循环的代谢速率降低，碳代谢流量发生改变并更多地 进入到磷酸戊糖途径。第二，一些关键氮代谢基因，如谷氨酰胺合成酶 GlnA 和 氮代谢调控蛋白 GlnR，在 37℃是显著下调的，而催化 2-酮戊二酸生成谷氨酸的 谷氨酸脱氢酶是上调的，这暗示 5008 在 37℃时处在高浓度谷氨酸环境下。进一 步利用氨基酸分析仪发现 5008 胞内谷氨酸浓度在 37℃时仅有 30℃的十分之一， 而谷氨酰胺的浓度较为接近，这暗示谷氨酸作为氮代谢前体在 37℃条件下主要 用于合成井冈霉素。在22个显著差异转录的调节基因中，一个SARP家族转录调节基因SHJG0322 的转录展现出最高的温度敏感性（128倍）。该基因缺失突变株JG27在30℃条件 下井冈霉素产量接近于菌株5008，而在37℃条件下其产量不到5008的20 %。转录 分析结果显示valA和valK在37℃分别上调了100倍和26倍，而在JG27中都只上调 了6倍。分别使用红霉素抗性基因强启动子和天然启动子控制下的SHJG0322对 JG27进行回补，发现回补菌株在37℃条件下产量都上升到5008的80 %以上。这表明SHJG0322作为正调节基因参