利用农杆菌对两种微藻进行遗传转化的初步研究-生物工程专业论文 word格式.docxVIP

利用农杆菌对两种微藻进行遗传转化的初步研究摘要随着微藻基因工程的飞速发展，使用基因工程手段对藻类进行深入研究及遗传改造已经越来越需要。但是，藻类的遗传转化体系一直是一个限制步骤，没有获得很好的解决。农杆菌(Agrobacterium)是一种天然的遗传转化系统，操作简单、费用低廉、转化效率高，插入片段稳定性高，因此在高等植物的遗传转化方法中成为首选。近几年，有关研究报道将农杆菌介导转化从高等植物移植到微藻中并获得成功。莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea) 是微藻基因工程中常用藻类。本实验期望利用gfp 基因作为报告基因，通过构建农杆菌双元载体，尝试进行农杆菌介导法实现对这些微藻进行外源基因的遗传转化。本实验具体研究内容及结果如下：1.构建pET-28a-gfp 表达载体，并将其转入大肠杆菌BL21 中，使用IPTG诱导GFP 蛋白的表达。结果显示，通过荧光显微镜观察可看到GFP蛋白特异的绿色荧光，说明gfp 报告基因在原核表达系统中成功表达，为下一步构建农杆菌转化载体转化单细胞绿藻进行了实验体系的确认。2.将莱茵衣藻CC-124和椭圆小球藻FACHB-40涂布于不同浓度潮霉素的平板上，检测这两种微藻对潮霉素的敏感性，从而选取30μg/ml 和80μg/ml分别作为本实验中衣藻和小球藻遗传转化时的筛选压力。3.将报告基因gfp和筛选标记基因hpt串联插入农杆菌双元转化载体pSB130，构建高效遗传表达载体。我们在gfp基因和hpt基因两端分别添加真核启动子和终止子，以确保这两个基因各自的表达。其中所使用的启动子包括常用于高等植物及真核藻类外源基因表达中的真核生物病毒启动子CaMV35S以及我们从土壤单细胞绿藻Cocoomyca C-169 中所克隆的自身高效启动子R。已构建了由CaMV35S 启动子启动GFP 表达的pSB130-35S-gfp-35S-hpt 转化载体和由R 启动子启动GFP 表达的pSB130-35S-hpt-R-gfp 农杆菌双元转化载体，并通过电转化法成功转入到农杆菌菌株EHA105 中，获得了同时带有报告基因和筛选标记基因的农杆菌转化菌株。4.通过将带有构建载体的农杆菌菌株与上述微藻共培养的方式进行遗传转化，然后把微藻重新转移至带有潮霉素的平板上进行筛选。但由于时间关系，目前还没有获得阳性克隆。通过本实验的进行，我们将在本实验室建立一套高效、实用、简便的农杆菌Ti 质粒介导的微藻转基因体系，期望首先在莱茵衣藻和椭圆小球藻中得到报告基因的高效表达，为今后藻类基因功能等研究的进行奠定基础。关键词：农杆菌双元转化载体；遗传转化；莱茵衣藻；椭圆小球藻；GFP 基因PreliminarystudyofgenetictransformationoftwospeciesofmicroalgaebyAgrobacteriumtumefaciensAbstractWiththerapiddevelopmentofgeneticengineeringformicroalgae,theuseof geneticengineeringmethodstoconductthethoroughresearchandgenetic modificationtothealgaehasbeenincreasinglyneed.However,genetic transformationsystemforalgaeisstillalimitingstep,hasn’tbeenresolved completely.Agrobacteriumtumefaciensisakindofnaturalgenetictransformation systemwithsimpleoperation,lowcostandhightransformationefficiencyand stability.Thereforeitbecomesagoodchoiceinthegenetictransformationofhigher plants.Inrecentyears,somestudiesreportedthesuccessfultransformationfor microalgaemediatedbyAgrobacterium,usingthemethodtransplantedfromhigher plants.ChlamydomonasreinhardtiiaswellasChlorellaellipsoideaarecommonlyused speciesinmicroalgalgeneticengineering.Inthisexperiment,wearet