08 第八篇章 基因工程与体外表达.pptVIP

基因工程与体外表达 Gene Engineering and Gene Expression ; 基因工程是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。 ;?????第一节 基因工程中的工具酶 一、限制性核酸内切酶（restriction enzyme） 它是一种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。 ; ;2．限制性内切酶的命名 EcoRⅠ E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株 ;3．限制性内切酶的识别和切割位点 通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ粘性末端（sticky end）。 ;PstⅠ切割后产生3ˊ粘性末端：;10;11;2. DNA聚合酶Ⅰ大片段 DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 ;Klenow片段的主要用途有： (1) 补齐双链DNA的3ˊ末端。 ;(2) 通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。 5ˊ-G-OH Klenow 5ˊ-GTT*A*A-OH 3ˊ-CAATT-OH d*ATP,dTTP 3ˊ-CAA T T-OH (3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。 (4) DNA序列分析。;3. 逆转录酶（reverse transcriptase） 是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA， 合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无3ˊ→5ˊ外切酶活性。 ;16;4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase） T4 DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。 ;18;5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。 ;20; 6. 末端脱氧核苷酸转移酶 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT），简称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到DNA的3ˊ-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。 ? ;22; 第二节 基因克隆的载体 ;一、质粒（plasmid） 质粒是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。 ;作为克隆载体的质粒应具备下列特点： （1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。;26;27;28; 质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。 ;二、λ噬菌体 噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌的病毒， 用作克隆载体的噬菌体有两种：一种是λ噬菌体，另一种是M13噬菌体。 野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。 λ噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。 目前应用较广的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。 ;; λgt10和λgt11载体适用于建立cDNA文库。这两个载体都属插入型载体，能克隆7kb以下的外源DNA。 λ gt11为表达型载体。;;三、粘性质粒（cosmid） 粘性质粒是由λ噬菌体的噬菌体的粘性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达40～50kb。 ;四、M13噬菌体 M13噬菌体（M13 phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长约6.5kb。M13感染细菌后