第九章 第十章 课件.pptVIP

第九章 细胞培养在实验 研究中的应用;一、药物开发中的应用：;注意：; 适用于单质药物测试，实验结果易于分析，但复方药或中药进行实验时，分析和评估实验结果应持谨慎态度。 被检药物需具有水溶性，若非水溶性药物测试时应有溶剂对照组，以排除溶剂作用。 尽量选取多种细胞类型，扩大检测范围。 总之，培养细胞比较适用于抗癌药的检测，常用于检测抗癌药和三致（致畸、致癌、致突变）等有害物。 ;（一）细胞选择; ③检测抗癌药物应根据药物抗癌谱选用细胞。药物无瘤种特异性时，可应用如HeLa、KB、BGC-823等各种细胞系或株。如有瘤种特异性时，则应根据抗癌作用要求选用上皮细胞起源的癌或中胚层起源的肉瘤细胞等。 总的原则是：药物与细胞种类的一致性或符合性越大越好，结果更具有参考价值。 ;2．对照细胞的选择;原代培养细胞：刚离体培养，性状与体内 细胞近似性大。 动物细胞培养：对细胞类型要求严格，且 不能用人成纤维细胞时。 注意 抗癌药物测试实验分组应注意： ① 实验组：加药的癌细胞； ② 对照组：不加药的癌细胞和 加药的正常细胞。;（二）检测药物 1. 药物的溶解和保存 水溶性药物，用不完全培养基或Hank’S液配制100×母液，用时按所需浓度进行稀释。 非水溶性药物，可以用DMSO或无水乙醇进行配制，要求在药物工作浓度下， DMSO和无水乙醇的浓度要小于0.2%（V/V），这时不会对细胞产生毒性。 进行实验时，对照组要加入同等量的溶剂。 所配制的母液一般在–20℃保存，一些光敏药物还需避光保存。; 2.药物活化 采用培养细胞进行药物检测，有时不能反应体内情况，有些药物经过肝脏后，会发生生物转化作用，可能会使原来没有毒性的药物产生毒性。 为弥补这一缺陷，可进行与体内环境比较相似的药物活化实验。采用大鼠或人的肝细胞活检材料和S9混合液在体外将药物活化。 受试药物和S9混合液与细胞接触时间一般为6h。;S9混合液的配制：;3.药物剂量的确定;4. 细胞形态和增殖生长反应;细胞形态和生长改变与药物效应经验等级： 0度：细胞在一定剂量和一定时间的药物作用下，无任何反应，细胞形态正常、增殖生长能力无改变。 1度：细胞增殖速度减缓，分裂指数下降，镜下观察细胞轮廓微增强，反差增大，但细胞仍能增殖生长。 2度：细胞增殖生长非常缓慢，细胞分裂指数显著下降或近于消失，细胞轮廓增强，胞质粗糙，内有颗粒堆积。 3度：细胞增殖生长完全停止，分裂相消失，细胞体回缩，细胞相互间隙加大，细胞轮廓非常明显，胞质极度粗糙，内充满多量堆积物。 4度：大部细胞脱落死亡，残余细胞亦濒死或崩溃溶解。;抗癌药效应剂量： 在一定剂量下，对正常细胞的影响为0～1度，但能明显抑制癌细胞生长增殖或破坏其形态结构的药物和剂量是有效的，即药物对正常细胞和癌细胞的作用差别越大，效果越好。;（三)测试程序（以抗癌药为例）：  ① 细胞：根据已知药物的特点 ，选用适当的细胞。实验细胞：药效特点不明时，可用HeLa、KB、Detroit等通用细胞。对照细胞：原则是越近似越好。例如被检药物为抗人胃癌药，对照细胞应：人正常胃上皮细胞→其他上皮细胞→人成纤维细胞→动物的胃上皮细胞→动物初代肝细胞。;② 加药： 加药时间：;药物作用持续时间： ;③ 观察：从实验开始，每天或间隔一定时间取一组细胞观察。观察指标：;分子细胞学检测：根据药物作用特点，可进行特定基因表达或变异的检测。 细胞死亡：致死效应是药物检测中特别是抗肿瘤药的重要指标。凡能引起细胞内相互制约系统中一个或多个环节的紊乱，最终导致细胞机能障碍、进而缓慢死亡的现象，也应视为细胞死亡的范畴。因此确定细胞死亡必须有一个时间范围。药物遗传毒性测试：反应化学药物的遗传毒性的检测可以分为4类：DNA损伤、基因突变、细胞遗传学改变（染色体畸变和姐妹染色单体互换）、细胞转化。 ;注意：用培养癌细胞检测抗癌药物所得结果，仅作参考，不能作为临床应用的直接依据；确证药物抗癌效应，尚需动物试验，体外培养细胞不能代替动物实验，不能代表体内作用。 ;二、细胞培养在杂交瘤技术中的应用杂交瘤细胞：肿瘤细胞和体细胞融合形成的杂交细胞。杂交瘤技术：