人教版高二生物选修一教学教学讲稿《专题5课题3 血红蛋白的提取和分离》 (共39张PPT).pptVIP

课题3 血红蛋白的提取和分离 血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。 血红蛋白 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团 血红蛋白的特点： 一、基础知识: 【思考1 】: 1 、分离生物大分子的基本思路是什么？ 2 、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？ 3 、本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？ 4 、为什么不用鸡的血红细胞而用哺乳动物的血红细胞作为实验材料？ 5 、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质 ？ 一、基础知识--蛋白质提取和分离原理 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质： 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。 提取分离方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法 1、原理： 2、材料- 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 凝胶 (一)凝胶色谱法 （分配色谱法）： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法 分子量 大 小 直径大小 运动方式 运动速度 运动路径 洗脱次序 一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理 大于凝胶颗粒孔隙 直径，被阻挡在颗 粒的外面 小于凝胶颗粒孔 隙直径，可以进 入颗粒内部 垂直向下移动 垂直向下移动， 无规则扩散进 入颗粒内部 较快 较慢 较短 较长 先从凝胶柱洗脱 出来 后从凝胶柱洗脱 出来 3、具体过程 一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理 凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 3、 缓冲液是如何配制的？ 4、 本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？ 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。 磷酸缓冲液 在本课题中使用的缓冲液是:__________ ,其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性) 2 .原理： (三)电泳 1.电泳的概念 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程. ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离 的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及 分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移 速度，从而实现样品中各种分子的分离。 凝胶电泳原理示意图 在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率完全取决于分子大小。 (三)电泳 3.类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 4 .聚丙稀酰胺凝胶电泳分离过程： 二、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理： 包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集 到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离： 透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化： 通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定： 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。 ↓ ↓ ↓ （一）样品处理 血液 血浆 水 分 固体物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细 胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （90％） 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团 血液的成分 （一）样品处理及粗分离 1、红细胞的洗涤： （2）目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固 血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色 （1）步骤： 柜式离心机 初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 在蒸馏水和甲苯作用下搅拌，红细胞破裂释放 2 、血红蛋白的释放： 蒸馏水的作用是 加入甲苯的作用是 充分搅拌的目的是 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 搅拌器转子 磁力搅拌器 搅拌器正在工作 3.分离血红蛋白 分离过程 红细胞 混合液 中速离心 10min 离心管 滤纸 过滤 脂类物质 烧杯 红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000r/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明液体。 分离血红蛋白溶液 有机溶剂 无色透明的甲苯层 脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液 红色透明液体 红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物 20mmol/L磷酸缓冲液 1mL 1mL 4、