第八章 非线性色谱原理及其在蛋白质分离与纯化中的应用介绍.pptVIP

第三节 非线性色谱的实验方法 由于非线性色谱涉及的样品浓度大大高于线性（分析型）色谱的，因此通常的分析型色谱仪及其流程就不完全符合非线性色谱的要求，某些部件必须加以改造才能满足要求，以便于在优化条件下使用，而且在实验方法上也需加以适当的改变。 一、非线性色谱中的固定相及色谱柱 1、固定相 在生物大分子分析型高效液相色谱中的固定相目前几乎都是用细颗粒大孔径的填料，但是在非线性色谱中，粗和细的可以两者都在使用。原则上讲细颗粒填料的柱效要高，但价格也贵。粗颗粒填料虽柱效低，但价格便宜，而且柱压降低适合于大型制备柱。 材料：填料的基体仍以硅胶和有机树脂两大类为主。如果硅胶和有机树脂基体的理化性能（如孔隙度、颗粒大小、比表面及键合的官能团）都一样，那么他们呈现的色谱性能没有显著的差别。 孔隙度：填料孔径大小的要求对不同生物大分子也不一样，例如分离核酸要求孔径至少在50nm以上，分离蛋白质一般要求在30-100nm，而且随分子量不同而异。30-50nm可分离30-100kD的蛋白质，而分离100kD以上的蛋白质要求孔径在80-100nm。 孔径越大，比表面越小，因而，填料对样品的负载量也降低，而且机械强度也减弱。但是由于传质阻力减少而使不同范围的蛋白质都能得到分离，故使填料效率提高。 分离生物大分子的主要填料 1、反向填料：烷基链长是很重要的因素。反向填料上键合的烷基链长似乎与蛋白质的分子量也有反相的关系，即长链烷基填料适合于分离小肽，短链烷基适合于分离多肽及蛋白质。 2、疏水作用填料：这种填料的疏水作用比反向填料弱，主要是填料表面烷基密度小、链长短。 3、离子交换填料：包括强阳离子、弱阳离子、强阴离子、弱阴离子4种填料。 4、体积排斥填料：无机填料一硅胶为主。有机填料中常用Pharmacia出的琼脂类填料。 5、亲和填料：亲和填料尽管选择性好，但最大的问题是商品种类太少，几乎对每一种生物大分子的分离都需要合成该种大分子所需要的特殊亲和填料。 2、色谱柱及填充技术 以分离纯化为主要目的的非线性色谱与分析色谱一样，色谱柱是极关键的部分。 色谱柱关键考虑两方面，一是色谱柱的长度；二是柱的填充。 色谱柱长度的选择要考虑多种因素： 1、为达到一定的分离度就要求有一个起码的柱长，否则分离的组分就达不到所需的纯度。 2、不同的填充方法填充的色谱柱都有一个最长的限度，超过了这个限度，就无法得到均匀的填充床。 3、柱效也不是与柱长永远呈比例增长，超过某一长度，柱效不再随柱长增加。 4、高压泵的容量不允许使用很长的色谱柱。 5、在置换色谱中，超过了最佳柱长，反而会降低产率，提高成本 6、柱径的选择也很重要。 柱的填充 柱的填充目前主要仍用干法和湿法两种： 1、干法操作简单、方便，不需要特殊设备，但柱效一般较差，只适用于直径大于30μm的颗粒，而且更适用于直径较大的色谱柱。 2、湿法填充主要适用于20μm以下的颗粒填料，分恒流与恒压填充2种。 二、样品溶解与进样方法 用非线性色谱分离与纯化生物大分子时，制备合适的样品溶液是成败的关键之一。 1、蛋白质的溶解度有限，通常需加入其他试剂一增加它在水中的溶解度。 2、溶液的性质必须适应于所用的固定相，使大量的样品溶液导入色谱柱后不马上扩散，集中在柱头，以达到“塞式”进样目的。 适当溶液制备后，进样方式也十分重要。 保证大量样品溶液能均匀分布在柱的截面上，使轴向扩散与局部超载降至最小。 目前进样方式有两种 1、采用带样品管的六通进样阀。若样品管的容积太大（如大于1ml），在空管中会产生Poiseuille径向速度分布，使样品溶液带进入柱头时加宽，所以一个较好的办法是用大于固定相颗粒2-3倍的惰性实心颗粒填充样品管，可大大减少径向速度不均引起的进样区变宽。 2、用高压泵直接输送样品进入色谱柱，由于与流动相混合，所以能保证样品均匀进入柱头的横截面。要注意样品的浓度不能太高，以免析出沉淀。样品进入色谱柱也有多种方式，如中心注射、锥形注射、横截面注射等。中心注射在进样体积较小时，分离效果好，但随进样体积增大柱效逐渐降低，而横截面注射恰恰相反。 三、非线性色谱中3种常用的展开方式 超载洗脱、前沿分析和置换展开是非线性色谱中常用的3中操作方式。在实际工作中究竟选择什么方式要取决于样品的性质、所需的产品纯度及要求的产率。 1、超载洗脱 所谓超载洗脱与传统的洗脱色谱差别不大，只是样品在固定相上的负荷超过了线性洗脱色谱的容量。 当样品进入色谱柱后，其中不同组分随流动相以不同的速度移动，因而样品沿色谱柱展开时，由于不断被流动相稀释，浓度逐渐降低，形成较宽而平坦的峰。 控制洗脱色谱中分离效率的主要因素有两个。 ①样品的选择性。 ②单位柱长的扩散效应。 2、前沿分析 前