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第八章 目的基因的分离克隆;第一节 PCR技术在植物基因克隆中的应用;一、PCR直接扩增克隆目的基因;一）从基因组DNA扩增目的基因;二）从cDNA中扩增目的基因（RT-PCR）;cDNA合成的引物;以随机六聚体的核苷酸为引物 1）当特定mRNA中由于含有使反转录酶终止反应的序列；2) mRNA分子较大且3‘端非编码区序列较长难以得到全长序列的cDNA或完整的读码框时。 当使用随机引物时，cDNA第一链的合成可能起始于mRNA上的许多部位，从而保证得到mRNA的编码区和5‘端旁侧； 所有的RNA都可以作为cDNA第一链合成时的模板。;以特异的寡核苷酸为引物 PCR反应采用两个特异引物，cDNA第一链的合成与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。 用特异引物引发cDNA第一链合成的好处是仅产生需要的cDNA，并导致更为特异的PCR扩增。;二、PCR克隆已知序列旁侧的未知片段;cDNA末端的快速克隆（RACE技术）; 5‘-RACE策略： 以基因特异引物（GSP-RT）将mRNA特异性反转录为cDNA第一链； 在cDNA第一链3‘端加入poly（A）尾； 以QT和GSP1进行首次扩增； 以Q1和GSP2进行第二次扩增，最后获得5‘端目的片段。 ;经典RACE原理示意图;二) 新RACE;基本原理;新RACE与经典RACE比较;新RACE图示;;;;;第二节 基因文库技术分离目的基因;一、基因文库类别;意义： 使生物的遗传信息以稳定的重组体形式储存起来； 分离克隆目的基因的主要途径； 是复杂基因组作图的重要依据。 文库分离目的基因的主要内容： 基因的克隆； 克隆基因的分离； 分离基因的鉴定。 ;一）类别;基因组文库：是指某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。 cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 两者区别： cDNA文库具有时效性 cDNA文库只反应mRNA的分子结构;克隆文库：由克隆载体构建。载体中具有复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片段大量增殖。 表达文库：是用表达载体构建。载体中除克隆文库的元件外，具有控制基因表达的序列（如启动子、SD序列等），可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物 筛选：从克隆文库分离某的基因主要利用核酸探针；从表达文库分离某的基因除利用核酸探针外，还可以利用免疫学探针及生物功能进行筛选。;二）文库构建的基本程序;二、植物核基因组文库构建;植物基因组大小及克隆文库所需噬菌斑数; ;在λ噬菌体载体上构建基因组文库;植物基因组文库构建技术流程;2、核基因组文库构建的技术说明 较理想的置换型载体有EMBL、3EMBL4、 2001等，能容纳23kb外源片段，具有Spiˉ正选择表型。 载体臂的制备：用两个靠近的限制酶进行双酶切，防止填充片段与臂的重新连接。 DNA插入片段的制备：控制反应时间及酶量；防止酶切后的片段重新连接；1）碱性磷酸酶除去5‘末端磷酸基团，2）Klenow酶的凹陷末端不完全补平。;三、cDNA文库构建;一）RNA提取及 mRNA的纯化;二）合成第一链cDNA; 三）mRNA-DNA杂交分子变为双链cDNA; oligo（dG）引导合成法：在第一链cDNA分子尚未与mRNA模板分离之前，先在其3‘－末端加上一段oligo（dG）序列，然后通过碱性蔗糖梯度离心处理，使mRNA模板分子发生水解作用，回收全长的cDNA，以互补的oligo（dG）序列作引物引导第二链cDNA的合成。 ;cDNA合成过程;四）cDNA链的末端修饰;加接头：利用T4DNA连接酶将接头连接到cDNA平末端，（非平端可用Klenow补平），用限制酶进行消化，产生带粘性末端的cDNA。（此法须用甲基化酶对cDNA中的酶切位点进行保护或采用罕见的接头） 加衔接头（子）：;五）cDNA克隆载体;以质粒为载体构建cDNA文库;以λ噬菌体为载体构建的cDNA文库流程图;四、利用PCR技术构建植物cDNA文库;末端转移酶加尾法扩增cDNA;寡核苷酸衔接子法扩增cDNA;五、基因文库筛选方法;免疫学检测使用抗体探针，通过检测重组克隆表达出的蛋白质来筛选目的克隆。抗体探针只适用于表达文库的筛选，且只能筛选出表达了的克隆。 PCR筛选法是通过混合克隆的PCR，以尽可能少的PCR反应次数从含成千上万个克隆的基因文库中筛选出目的（阳性）克隆。;基因文库PCR筛选的“反应池”示意图;第三节 mRNA差别显示技术分离差别表达基因;1992年美国的liang和Pardee首次提出mRNA差别显示技术。 mRNA差别显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速并行