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第十二章基因诊断Gene Diagnosis;基因诊断之父—简悦威; 第一节 基因诊断的技术和方法 第二节 遗传病的基因诊断 第三节 传染病的基因诊断 第四节 肿瘤的基因诊断 第五节 基因诊断法医学上应用;第一节 基因诊断的技术和方法（以遗传病诊断为例）;遗传物质改变(诊断依据)： 一是基因或表达产物水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高等； 二是基因结构变化即突变，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活等。;基因诊断的特点 高特异性 高灵敏性 早期诊断性 应用的广泛性;1. Southern印迹杂交 提取DNA→ 限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。 ;2. Northern印迹杂交 用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析。 步骤：RNA经变性凝胶电泳后，将其转移到固相支持物上，以便用杂交反应检测特定的mRNA分子的含量与大小。;3. 斑点杂交;正常的（N）的： 5′-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3′ 突变的（M）的： 5′-ACT CCT GTG GAG AAG TCT GC-3′ ;正常的（N）的ASO探针： 5′-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3′ 突变的（M）的ASO探针： 5′-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3′ ;Allele Specific Oligonucleotide （ASO） 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，因此可用人工合成的针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。;斑点杂交;4. 反向斑点印迹杂交 探针先固定于膜上。用一张含有多种特异性寡核苷酸探针的膜与待测目的基因杂交，经过一次杂交便可同时筛查出被检DNA中的多种突变。;举例：β-地贫的反相斑点杂交分析;（二） 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR）;PCR在基因诊断中的应用;1. RT-PCR;2.荧光定量PCR; 3.多重PCR;;5. AS-PCR（allele specific PCR）等位基因特异PCR：根据引物3′端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物;（三）单链构象多态性分析（ Single-strand conformation polymorphism，SSCP）;PCR-SSCP分析原理示意;正常人;（四） 限制性片段???度多态性分析Restriction Fragment LengthPolymorphism（RFLP）;;镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析;+;PCR-RFLP 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一或数个多态性的限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR 产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。 ;举例：HBS的PCR-限制性内切酶谱分析 ;（五） DNA序列测定（DNA sequencing）;病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，如图2所示，左侧正常对照第225位碱基为C，而该患儿为A;表12-2 基因诊断中常用的分子生物学方法比较;方 法;（六）生物芯片（biochips）;宏阵列(Macroarray);cDNA芯片杂交流程示意图;三、 基因诊断技术路线与方法;（一）直接诊断途径;举例：β-地贫的PCR-RE（直接诊断）;举例： ?地中海贫血的直接基因诊断;BamHI;Southern blot 检测结果：; M：50bp DNA标准；1：LNCaP阳性对照；2：BPH；3：健康男性志愿者；4～10为PCa；11为试剂空白。 ;（二）、间接诊断途径;2. 遗传标记 DNA多态性：指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上DNA核苷酸序列存在一定的差异或变异。 多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系;RFLP 标记的连锁分析;甲流病毒颗粒;结核分枝杆菌 先设计一对特异性引物，用PCR技术扩增出一383 bp序列，再用探针杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。 幽门螺杆菌（HP） 主要采用PCR技术：①检测HP染色体DNA特异片段；②检测HP尿素酶A基因；③用PCR-RFLP鉴别HP菌株。; 第四节 肿瘤的基因诊断;英国三姐妹一起割乳预防癌症 ; 第五节 基因诊