第三章 细胞生物学研究方法推荐.pptVIP

* （三）扫描隧道显微镜（STM） ? 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV－2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 ? 分辨率：横向为0.1－0.2nm，纵向可达0.001nm。 ? 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。 * 扫描隧道显微镜原理 * 思考： 比较电子显微镜和光学显微镜的优点及缺点。对下列目标你用什么方法做最佳观察：一个活的皮肤细胞、一个酵母线粒体、一个细菌、一条微管 能否用透射式电子显微镜反映样品的表面立体形貌，而用扫描式电镜反映样品内部的状况。 * 三、显微操作技术 ? 在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 ? 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 – 细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等上个世纪70年代在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。 * 显微操作仪 * 第二节 细胞组分的分析方法 一、离心技术 ? 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段 ? 转速为10－25kr/min的离心机称为高速离心机 ? 转速25kr/min，离心力89Kｇ者称为超速离心机 ? 目前超速离心机的最高转速可达100kr/min，离心力超过500Kg。 * （一）差速离心 ? 特点： – 介质密度均一； – 速度由低向高，逐级离心。 ? 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 ? 沉降顺序：核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高基体—核蛋白体。 ? 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 * * （二）密度梯度离心 ? 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。 ? 类型：速度沉降、等密度沉降。 ? 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 ? 分离活细胞的介质要求： – 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； – 2）PH中性或易调为中性； – 3）浓度大时渗透压不大； – 4）对细胞无毒。 * 四、免疫细胞化学 ? 根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。 ? 免疫荧光法：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。 ? 酶标免疫法：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明沉积物，从而显示出抗原存在的部位。 * 五、放射自显影术 ? 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 ? 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。 ? 一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3HUDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。 – 14C半衰期为5730年，3H为12.5年。 * 二、流式细胞术 ? 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 ? 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计。 * * 三、细胞电泳 ? 原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。 ? 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。 ? 用途：检测细胞生理状态和病理状态、分离不同种类的细胞，如分离哺乳动物的XY精子。 * 第三节细胞培养与细胞杂交 一、细胞培养 （一）动物细胞培养 ? 群体培养：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层 ? 克隆培养：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。 – 转鼓培养法：为制取细胞产品而设计，大容量旋转培养，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中。 * 原代培养：即：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养 ? 细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具