麋鹿隐孢子虫病的检测方法.docVIP

引言 隐孢子虫（Cryptosporidium）是细胞内寄生原虫，能感染人与多种动物的消化道和呼吸道而引起隐孢子虫病（Cryptosporidiosis)[1]。自从Tyzzer[2]在小鼠粘膜组织中发现小鼠隐孢子虫(C. muris)以来，隐孢子虫已经被认为是世界脊椎动物中的一种广泛传播的重要寄生虫，包括中国在内，隐孢子虫已经在世界上六个大洲90个国家发现[3,4,5]，并经常在婴儿和儿童中发现。现今被公认的隐孢子虫有14种，其传播途径以卵囊经粪-口途径为主[6,7]。与其它介水传播性原虫相比，隐孢子虫因粒径小于10 μm和自身对消毒药的较强抵抗力而被净水工艺除去的难度更大，即使在滤过水中，卵囊的检出率在英国和美国分别达到37%和26%，因此，隐孢子虫污染已经成为水源监测的重要指标[6,8]。如今，隐孢子虫能感染包括人在内的240多种动物，其中包括野禽、两栖动物等许多野生动物，是现今引起动物腹泻的主要病原之一，严重威胁着人和动物的健康，造成了巨大的经济损失。 麋鹿属于国家一级保护动物，是中国特有的动物，也是世界珍稀动物，曾经是国际自然保护联盟IUCN(World Conservation Union）红皮书规定的极危物种。目前，虽然世界的麋鹿总数已经繁殖达4000头，但仍然是濒危物种。近几年来,隐孢子虫屡次在野生和人工饲养的多种鹿类中发现，严重威胁着鹿的健康，而至今未见关于麋鹿隐孢子虫病的调查。因此，积极开展麋鹿隐孢子虫病的流行病学调查，对其防治有着重要的意义。 1 材料与方法 1.1 样品采集与保存 从2010年到2011年，应用一次性手套，采集北京与大丰麋鹿自然保护区自然环境中新鲜的麋鹿粪便，编号，置于冰壶，并同时记录粪便的颜色与性状。其中，北京采集样品23个，大丰87个。样品处理前，4℃低温保存。 1.2 试剂 改良抗酸染色液：甲液(石炭酸复红4 g，95 %乙醇20 ml，苯酚8 g，双蒸水100 ml)，乙液(纯硫酸10 ml,蒸馏水90 ml)，丙液(0.2 g孔雀绿，蒸馏水100 ml)。饱和盐水(1000 ml水加热至沸腾加氯化钠至不溶为止)。 胎牛血清、甲醇、蒸馏水。 1.3 试验材料 载玻片、盖玻片、20 ml试管数只、试管架、酒精灯、镊子、一次性手套、口罩、锥形瓶、烧杯、EP管(0.5 ml、0.2 ml、7 ml、10 ml )、移液器、枪头、记号笔、过滤纱布、漏斗、玻璃棒、标签纸等。 1.4 试验仪器及设备 光学显微镜(OLYMPUS-XDS-1B)、数码相机(OLYMPUS)、通风橱(苏净集团安泰公司制造)、可调万用电炉(龙口市电路制造厂)、电子天平(上海精天电子仪器有限公司)、离心机(湖南星科科学仪器有限公司) 1.5 试验方法 通过饱和盐水漂浮法和改良抗酸染色法来对麋鹿隐孢子虫卵囊进行检查。具体操作步骤如下所述。 1.5.1 饱和盐水漂浮法 按编号取麋鹿粪样3 g于20 ml试管中，将试管依次编号，加入已经配制好的饱和盐水，用玻璃棒充分搅拌，静置15~30 min后，过滤至已编号的待用试管中。将滤液5 ml一一对应倒入已编号的10 ml EP管中，加水适量，放入离心机，3000 r/ min，离心10 min。取出弃掉上清液，用移液器取5 ml蒸馏水加入与管内离心剩余物充分混匀，重复以上离心步骤。取出后弃去上清液，用移液器取200 μl蒸馏水与离心产物混匀，取出放入500 μl EP管中置于4℃冰箱中保留备样。 用移液器取2 μl牛血血清与载玻片上，按编号依次取20μl漂浮液与之混合，盖上盖玻片，40倍物镜镜检。 1.5.2 改良抗酸染色法 按编号取麋鹿粪样3 g于20 ml试管中，将试管依次编号，加入已经配制好的饱和盐水，用玻璃棒充分搅拌，静置15~30 min后,过滤至已编号的待用试管中。之后，将过滤液5 ml一一对应倒入已编号的10 ml EP中，加水适量，放入离心机离心，要求转速3000 r/ min,离心10 min后，取出弃掉上清液，用移液器取5 ml蒸馏水加入与管内离心剩余物充分混匀，之后再重复以上离心步骤。取出后弃去上清液，用移液器取200 μl蒸馏水与离心产物混匀，之后取出放入500 μl EP管中置于4℃冰箱中保留备样。 用移液器取2 μl牛血血清与载玻片上，按编号依次取20 μl漂浮液与之混合，涂成直径约为1 cm大小的圆，用标签纸将载玻片编号，待其自然干燥后，用酒精灯进行固定，之后进行染色。先用甲液染色5 min，水洗，再滴加乙液，脱色2~5 min，水洗之后，再滴加丙液30 s，之后水洗晾干即可镜检。 1.6 检测指标 1.6.1麋鹿隐孢子虫的感染强度 隐孢子虫感染强度的判定主要是根据有关文献资料的判定标准,并做相应的改进。