组织污染的检测与排除-夏开德.pptVIP

细胞培养的污染和排除 夏开德 中南大学医学遗传学国家重点实验室 凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成 细胞不纯的异物，都应视为污染。 污染应包括: 微生物：真菌、细菌、支原体和病毒(最常见） 化学物质：影响细胞生存的非细胞所需的化学 成分 细 胞：非同种的其它细胞　　　　 细胞污染: 污染 微生物的污染 不同细胞类型的交叉污染 细菌 霉菌 支原体 化学物质污染 污染途径： 　１．空气: 培养设施不宜置于通风场所； 定期清理净化工作台的过滤层，防止阻塞； 　操作中应减少空气流动； 带口罩； 　夏季潮湿季节空气中含菌数量多，每立方米内含菌数不应超过1～5个。 　 ２．清洗消毒 　培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等，都可引入有害物。 ３．操作 　实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口时不严，都可发生污染。同时培养两种以上细胞，操作不慎，使用同一吸管或培养用液，可能导致细胞交叉污染。 ４．血清 　血清也是污染细胞的来源，有的市售血清制备水平低、检测不严，常已被支原体和病毒污染。 　５．组织 　初代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织(如 　已经发生溃烂的肿瘤组织)；手术用碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染 污染对细胞的影响 根据污染物和污染程度的不同，对细胞的影响不同 在细胞受有害物污染时间短、污染程度轻、并能及时排除污染物的情况下，细胞有可能恢复。 当污染物持续存在于培养环境中时，轻者细胞增殖生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增强，重者细胞停止增殖，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。 微生物污染及其表现： 　１．真菌污染： 　真菌种类繁多，形态各异，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。 ２．细菌污染：细菌污染后大多能改变培养液 pH使培养液变混浊，毒性大的细菌很快导 　　致细胞崩解死亡。 　　加用抗生素的培养用液一般可预防和排除 个别少量细菌的污染。 ３．支原体污染 　　支原体是细胞培养中最常见、不易被 　　察觉和干扰实验结果的一种污染。 真菌感染 支原体污染 电镜照... 细菌污染 扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体 污染的预防和排除 重在预防，排除困难！ 1.器皿准备中的预防 2.开始操作前的预防 3.操作过程中的预防 4.其他方面的预防 细胞培养过程中预防污染的措施。﹙一﹚器皿准备中的预防 ﹙二﹚开始操作前的预防： ﹝1﹞定期清洗或更换超净工作台的空气滤网。﹝2﹞检查培养器皿是否有消毒标志。 ﹝3﹞检查新配制的培养液。 ﹝4﹞操作前提前0．5小时启动超净工作台及 　　　紫外消毒灯。 ﹝5﹞操作者应消毒双手和戴口罩。 ﹙三﹚操作过程中的预防： 不用的立即封口，不允许用手触及器皿的无菌部分。 在安装吸管帽，开启或封闭瓶口操作时要经过火焰烧灼，并在火焰附近工作。 吸管应专管专用。 培养的细胞在处理之前勿过早暴露于空气中。 操作时不要交谈，咳嗽。 操作完毕后应将工作面整理好，并消毒擦拭工作面，关闭超净工作台。 ﹙四﹚其他方面的预防： 应及早冻存有价值的培养物。 对新引进的细胞株应加强观察，防止外来的污染源。 应定期更换培养系统中的抗生素。 定期清洁消毒CO2培养箱。 污染的排除 1．抗生素排除法：联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后使用好。 一些有价值的细胞被污染后，可采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24～48小时，再换入常规培养液。有时可能奏效。 2.加温除菌 (用于清除支原体） 根据支原体耐热性能差的特点。有人将受支原体污染的细胞置于41℃中作用5～10小时(最长可达18小时)以杀灭支原体。但41℃对培养细胞本身也有较大影响，故在处理前，应先进行预试验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。 3.动物体内接种 　受微生物污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭污染的微生物，肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出再进行培养繁殖。 4.与巨噬细胞共培养 　巨噬细胞在体外培养条件下仍然可吞噬微生物并将其消化。利用96孔培养板将极少量的培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度的同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染的效能。本方法与抗生素联合应用效果更佳。 谢谢