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层析分离技术（8） 7.8 柱层析分离的工艺设计策略及典型实例 一、柱层析分离的工艺设计策略 二、柱层析分离的典型实例 一、柱层析分离的工艺设计策略 1. 宏观纯化策略的确定 2. 层析分离模式的选择 3. 柱层析分离的工艺条件 4. 规模放大的指导方针 1. 宏观纯化策略的确定 设计一个未知物质的纯化方案，首先需要知道该物质的用途和纯度要求。 如果用于实验室研究，则对分辨率具有较高要求，主要考虑产品的纯度，可以牺牲得率，不计成本，因此，可考虑使用预装柱、亲和层析技术及高效液相层析等方案，快速高效地获得高纯度产品。 如果是临床研究或生产规模的应用，由于用量较大，成本问题就上升到重要位置，原材料的来源、杂质的含量以及目标物质含量的多少都需要认真考虑。 1. 宏观纯化策略的确定 总结现代蛋白质纯化的经验和特点，基本可归纳为三步纯化策略： 1）捕获：分离、浓缩或稳定目标物质，初步纯化粗提取液，起到浓缩或稳定作用（如去除蛋白酶等），这就要求层析交换容量大、流速高、处理快； 2）中间纯化：除去绝大部分主要杂质，这既要求层析交换容量要大，同时分辨率也要高； 3）精纯：去除任何残存的痕量杂质或密切相关的杂质如目标物质的结构变异体、多聚体等，在该阶段首先考虑分辨率及产品的最终要求，其次考虑产品的回收率及成本。 2. 层析分离模式的选择 使用层析技术分离纯化生物物质时主要根据以下几个方面来选择不同的层析分离模式： ①目的产物的分子结构、化学物理特性及相对分子质量大小； ②主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特性与目的产物相近的杂质种类与含量； ③目的产物在层析分离过程中生理活性的稳定性； ④纯化过程中所处的纯化阶段。 2. 层析分离模式的选择 根据以上宏观纯化策略，任何物质的分离纯化大致均可分为捕获、中间纯化及精纯三个阶段，由于每个阶段的目的、要求及成分不同，其分离模式也有所不同，因此在整个分离纯化工艺过程中，常常是多种分离模式的联合使用，这就涉及到不同层析模式的合理组合及其先后顺序问题。 不同的层析分离模式由于其原理的差异适用于不同的起始条件及得到不同的结束条件 。 2. 层析分离模式的选择 理想的情况是前一个柱层析分离模式的结束条件等同于后一个柱的起始条件： IEC→HIC→GFC、 IEC→AFC→GFC、 (NH4)2SO4沉淀→HIC→IEC→GFC、 HIC→IEC→RPC 可以有效地简化纯化工艺，从而降低成本。 3. 柱层析分离的工艺条件 确定了纯化工艺中的层析分离模式及其组合方式后，还需要对每种层析分离工艺条件进行选择及优化，从而提高产品的纯度和收率。 柱层析分离的工艺条件包括层析柱的尺寸大小、层析介质的种类、层析操作条件（如缓冲液的种类、盐离子浓度、 pH、流速、洗脱方式等）。 4. 规模放大的指导方针 在实际应用中，存在一个规模放大的问题。对于层析技术来说，规模放大应该是线性放大。 在此基础上可依据的标准很多，如维持床高、线性流速、样品浓度、梯度斜率/床体积比、样品保留时间等因素的恒定，而分别增加样品体积、柱直径、样品流速、梯度体积等。 二、柱层析分离的典型实例 1. 天然蛋白的分离纯化 2. 重组蛋白的分离纯化 1. 天然蛋白的分离纯化 天然蛋白的分离纯化具有以下特点： ①原材料种类繁多，同一种目的蛋白可以来源于动物、植物及微生物等，来源不同其含量和特性有所差异。 ②目的蛋白含量低 ③杂质成分复杂 ④纯化过程需要保持目的蛋白的生物学活性。 酶的分离纯化 由于酶对其底物或酶抑制剂具有较强的特异性结合能力，因此在纯化过程中，常采用亲和层析技术，以其底物或酶抑制剂作为亲和配基。 但由于亲和层析介质价格昂贵，而天然酶含量又较低，在实际应用中，常采用亲和层析与其他层析技术联合使用， 首先使用价格低廉的离子交换层析除去大量的杂质， 然后再采用亲和层析技术得到高纯度的产品。 酶的分离纯化 例如，从鲫鱼肌肉中分离纯化肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（Myofibril-bound Serine Proteinase, MBSP）: 使用了酸沉淀预处理、 Q-Sephrose Fast Flow阴离子交换层析 Benzamidine-Sephaose 6B亲和层析技术 利用Sephacryl S-200凝胶过滤层析测定了鲫鱼MBSP的分子量 MBSP的纯化工艺设计符合以上描述的三步纯化策略，即提取工艺、中间纯化及精纯。 ①提取工艺 ②中间纯化 将以上获得的MBSP粗提液用1 mol/L NaOH调节pH至8.0，用20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）进行透析。 此时目的蛋白MBSP表面带有负电荷，因此选用阴离子交换层析柱Q-Sepharose（2.5×16 cm）对MBSP进行中间纯化，其目的是除去大量