以核糖体rna基因间区为靶序列的物种分子生物学鉴定分析-生物学;生物化学与分子生物学专业论文.docx

摘要以核糖体RNA基因间区为靶序列的物种分子生物学鉴定研究摘要核糖体RNA基因间区是研究物种分子生物学鉴定的常用重要指标，它含量大，并且普遍存在于各种生物当中，是物种系统分类学研究中最有用和最常用的靶基因序列。检测手段的创新能够迅速推动物种鉴定领域的发展。本文介绍了三种基于DNA水平的物种鉴定及定量的检测方法的研究。其中两种物种鉴定方法为食源性致病菌，分子定量方法为线虫相关。这三种方法分别是：1)利用环介导恒温扩增方法特异性鉴定食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的研究；2)利用交叉引物方法结合免疫杂交技术快速鉴定阪崎肠杆菌的研究；3)土壤线虫基因组DNA提取方法与分子定量方法的改进研究。1)利用环介导恒温扩增方法特异性鉴定食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的研究小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)是30年代引起注意的急性胃肠炎型食物中毒的病原菌，为人畜共患病。该菌易染人群为婴幼儿，常引起发热、腹痛和带血的腹泻。随着我国的快速发展，进出口货物明显增加。而目前检测小肠结肠炎耶尔森菌仍然沿用传统的生理生化方法，不仅所需时间长(约4天)而且浪费人力。这己明显不适合我国现状。用分子生物学方法检测小肠结肠炎耶尔森菌无疑是更好的选择。在本研究中，针对16S_23SrRNA基因转录间区(16S一23SrRNA internal transcribed spacer，ITS)序列，本学位论文研究设计和验证了一种环介导恒温扩增(100p-mediatedisothermalapplification，LAMP)检测小肠结肠炎耶尔森菌的方法。和PCR方法相比，该方法对实验设备要求低，仅需要简单操作即可高效快捷地完成。该方法灵敏度≥8CFU／ml，特异性为100％，经大量样品验证，与现行标准方法一致，已成为国家进出口检验检疫局新的行业标准。2)利用交叉引物方法结合免疫杂交技术快速鉴定阪崎肠杆菌的研究摘要阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)是一种分布极为广泛的肠道菌，特别在奶粉中的污染尤为严重。作为可严重危害生命安全的肠杆菌，由阪崎肠杆菌所引发疾病的致死病例可达40—80％以上。患者中又以婴幼儿为众，常常导致婴儿脑膜炎、败血症等严重疾病。因此，全球范围已经开发了多种检测鉴定阪崎肠杆菌的生理生化方法、PCR法以及LAMP法。但是这些方法都存在一些不足，如鉴定时间长、检测灵敏度低，和有害试剂的使用等。本学位论文针对阪崎肠杆菌16Sq3SrRNA．基因转录间区序列，研究设计和验证了一种交叉引物恒温扩增(cross—primingamplification，CPA)与免疫杂交分析技术(immunoblotting)相结合的阪崎肠杆菌鉴定方法。并且同时进行了国家出入境检验检疫局行业标准的阪崎肠杆菌PCR鉴定实验，作为CPA检测结果特异性与灵敏度的对照。结果表明，该CPA方法灵敏度为≥10fg DNA或≥12CFU／ml，特异性为100％，与现行标准方法完全一致。而且，扩增产物检测只需要免疫杂交试纸条，在5-10min内便可以知道结果。因此，该方法更适应于野外以及现场样品的检测。3)土壤线虫基因组DNA提取方法与分子定量方法的改进研究线虫(nematode)是一种在地球上存在数量极为巨大的多细胞真核生物。尤其在土壤中行使着各种不同的重要作用，对生态系统和碳元的代谢有着极为重要的作用。在这些线虫中存在着一大类植物寄生性线虫，它们可以导致农作物减产，全球平均每年造成157亿美元的损失。因此，对土壤线虫种类的鉴定就变得尤为重要。然而，虽然线虫具有如此重要的作用，但是目前常用的线虫鉴定方法仍旧是显微镜下线虫形态观察鉴定方法。该方法不仅需要消耗大量时间而且鉴定过程中需要使用多种对人身体健康有害的试剂。因此，最近许多研究报道提出以分子生物学鉴定方法替代形态学鉴定。但是，为了进行分子生物学鉴定的基因克隆测序，便需要PCR产生大量扩增产物。因此，也就对线虫基因组DNA的提取方法有了较高的要求。本实验通过针对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)和昆虫病原性线虫(Steinernemacarpocapse)18S一28SrP,NA基因转录间区序列，对现有的三种线虫基因组DNA提取方法(酚一仿法、氢氧化钠法、吐温20法)进行比较，并提出了一种全新的改进方法(TritonX-100法)。结果表明，在三种现在常用的线虫基因组DNA提取方法中，酚一仿法不适合进行少量线虫的基因组DNA提取，氢氧化钠法提取基因组模板PcR扩增量明显低于吐温20法，吐温20法是三种方法中线虫基因组DNA扩增产量最高也是最稳定的方法。但是，三种常用提取方法的PCR产物扩增量均无法达到TritonⅡ摘要X-100提取方法的水平。因此，TritonX一1