与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定-预防兽医学专业论文.docx

与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定目录中文摘要．．iAbstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．iii缩略表vil文献综述11．1弓形虫概述11．1．1弓形虫及弓形虫病．11．1．2弓形虫的生活史．21．1．3弓形虫的宿主31．2弓形虫感染宿主机制的研究进展41．2．1弓形虫入侵宿主细胞的过程．41．2．2弓形虫对宿主细胞的调节．61．3弓形虫微线体蛋白的研究进展71．3．1MICl／MIC钔订IC6复合物111．3．2MIC2／M2AP复合物111．3．3MIC3／MIC8复合物121．3．4AMAl以及移动接点复合物121．3．5其他微线体蛋白131．4弓形虫蛋白与宿主蛋白相互作用的研究进展．141．5蛋白质互作技术的研究进展．151．5．1酵母双杂交151．5．2免疫共沉淀171．5．3Pull-down．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．171．5．4双分子荧光互补l82研究目的与意义203材料与方法2l3。l实验材料。2l3．1．1实验动物213．1．2虫株、菌株和细胞21万方数据华中农业大学2015届博士研究生学位论文3．1．3载体与质粒213．1．4引物233．2主要仪器与试剂．．243．2．1主要仪器243．2．2主要试剂盒253．2．3主要试剂．253．2．4主要溶液的配制263．3实验方法．．283．3．1弓形虫RH株速殖子的培养、收集与纯化283．3．2弓形虫RH株基因组DNA的提取．．293．3．3弓形虫RH株速殖子总RNA的提取～293．3．4弓形虫RH株速殖子eDNA的制备303．3．5弓形虫微线体蛋白AMAl、MIC2和MIC3编码序列的获得．303。3．6重组载体的构建313．3．7酵母双杂交343．3．8与微线体蛋白MIC3互作的宿主蛋白编码序列的获得393．3．9原核表达与表达产物的纯化393．3．10GSTPull—down423．3．11哺乳动物细胞的培养和转染．．433．3．12免疫共沉淀一443．3．13Westernblot．．453．3．14双分子荧光互补。．453．3．15弓形虫速殖子对宿主Wnt／p-eatenin信号通路的影响．463．3．16微线体蛋白MIC3对宿主Wnt／13．catenin信号通路的影响．．464结果与分析．484．1弓形虫微线体蛋自AMAl，MIC2和MIC3编码基因的分析和获得484．1．1弓形虫微线体蛋白AMAl，MIC2和MIC3蛋白初级结构的分析．484．1．2弓形虫微线体蛋白AMAl，MIC2和MIC3编码基因的获得．494．2酵母双杂交诱饵质粒的构建，表达，自激活和毒性检测．．5011万方数据与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定4．2．1酵母双杂交诱饵质粒的构建．504．2．2酵母质粒在酵母中的表达检测504．2．3诱饵质粒的自激活和毒性检测514．2．4MIC2不同结构域酵母双杂交诱饵质粒的构建一524．2．5MIC2不同结构域诱饵质粒在酵母中的表达检测．．544．2．6MIC2不同结构域诱饵质粒的自激活和毒力检测．．554．3酵母双杂交筛选与弓形虫微线体蛋白AMAl、MIC2和MIC3相互作用的宿主蛋白564．3．1宿主互作蛋白的初步筛选564．3．2候选阳性克隆插入片段大小的鉴定及质粒拯救574．3．3候选阳性互作的回返验证594．3．4阳性插入片段的测序鉴定594-3．5阳性互作宿主蛋白的GO分类分析614．4MIC3与筛选宿主蛋白互作的验证624．4．1MIC3筛选宿主蛋白编码基因的获得一624．4．2MIC3与筛选宿主蛋白的酵母点对点验证．．644．4．3 MIC3与宿主蛋白Spata3，Dkk2相互作用的体外Pull—down验证．654．4．4免疫共沉淀验证MIC3与宿主蛋白Spata3和Dkk2的相互作用7l4．4．5双分子荧光互补验证MIC3与宿主蛋白Spata3和Dkk2的相互作用744．5MIC3与宿主蛋白互作结构域的鉴定764．6弓形虫对宿主Wnt／D．catenin信号通路的影响784．6．1弓形虫速殖子对宿主Wnt信号转导的影响．．784．6．2微线体蛋白MIC3对宿主Wnt信号转导的影响794．6．3弓形虫速殖子和MIC3蛋白对宿主Wm信号调控因子[3-eatenin表达量的影响．815{寸论．835．1与弓形虫微线体蛋白互作宿主蛋白的筛选．835．1．1鉴定与弓形虫微线体蛋白AMAl、MIC2和MIC3互作的宿主蛋白的重要1生83III万方数据华中农业大学2015届博士研究生学位论文5．1．2酵母双杂交系统的选择、应用．845．1-3诱饵质粒的自激活和