第四章酶的分离纯化考试.pptVIP

Chapter 4 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme 酶的分离纯化 4.1 酶的提取、分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物、植物或微生物细胞 发酵液 离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。 酶的提取纯化全过程包括三个基本环节： 预处理、提取纯化、制剂 （一）、 预处理 （将酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液） ? 抽提（在一定条件下用适当溶剂，将尽可能多的 酶、尽量少的杂质，从原料引入溶液，是 进行酶分离纯化之前的必需步骤）。 稀酸、碱、有机溶剂、盐抽提法 ? 破壁： 机械法：高速捣碎、匀浆、研磨； 物理法：渗透压冲击法、超声破碎； 化学法：丙酮、甲醛、丁醇、氯仿、表面活性剂； 酶法： 自溶、外加溶菌酶、几丁质酶； ? 浓缩： 吸水剂：Sephadex （葡聚糖凝胶）、 PEG（聚乙二醇）； 透析；（透析袋） 超过滤；（微孔超滤膜） 减压蒸发：旋转减压蒸发仪、薄膜蒸发器 酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。 酶分离纯化不同阶段 4.2 细胞破碎 许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎 JY92-II D超声波 细胞粉碎机 细胞破碎珠 高压细胞破碎机 DY89-I型 电动玻璃匀浆机 机械破碎 捣碎法 研磨法 匀浆法 物理破碎 温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 化学破碎 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 酶促破碎 自溶法 外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎 细胞破碎方法及其原理 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 4.3 酶的提取 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。 酶的主要提取方法 提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象 盐溶液提取 0.02～0.5mol/L的盐溶液 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 酸溶液提取 PH2～6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶 碱溶液提取 PH8～12的水溶液 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂 用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶 大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。 4.4 酶的分离方法 1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 Go Go Go Go 5、电泳分离 Go 6、萃取分离 Go 3、过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。 过滤 非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 过滤的分类及其特性 (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) 类别 截留颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 粗滤 2μm 酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞