磷酸化蛋白的分离与鉴别.pptVIP

磷酸化蛋白的分离与鉴别 磷酸化蛋白质研究的大事件 1906年，Levene和Alsberg 首次发现磷酸化蛋白--卵黄磷蛋白(phosvitin) 1955年，华盛顿大学的Edmond H. Fischer 和 Edwin G. Krebs教授提出蛋白质可逆磷酸化对于功能的调节作用 1992年， Nobel Prize in Physiology or Medicine 2002年，首次进行磷酸化蛋白质组的分析，鉴定S. cervisiae中上百个磷酸化位点 蛋白质磷酸化与细胞功能的关系 分离分析磷酸化蛋白的意义 蛋白质可逆磷酸化是最普遍最重要的一种蛋白质翻译后修饰 在哺乳细胞中大约有1/3的蛋白质被认为是磷酸化修饰的 蛋白质可逆磷酸化对众多蛋白质生物化学功能担负开/关调控责任 磷酸化蛋白质组学研究现状 SCI 收录文献数目 Key words：phosphorylation 磷酸化蛋白的特点 是一种可逆过程，是一个动态过程 相对丰度较低 样品处理过程中，可能会发生去磷酸化 磷酸化肽段质子化困难 磷酸化蛋白质组学研究目的及难点 研究目的： 对某一特定状态下，细胞内的特定蛋白质，在体内的磷酸化氨基酸残基定位； 鉴定与磷酸化过程有关的激酶； 分析所观察到的磷酸化现象对于功能的影响。 存在的难点： 磷酸化蛋白相对丰度低，动态变化范围宽 —发展选择性富集材料和方法 检测困难 —发展磷酸化蛋白鉴定技术 蛋白磷酸化的种类 1．O-磷酸盐，通过羟氨酸的磷酸化形成的，如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。 2．N-磷酸盐，通过精氨酸，赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的。 3．乙酰磷酸盐，通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。 4．S-磷酸酯，通过半胱氨酸的磷酸化形成的。 磷酸化位点的分布情况 丝氨酸 serine 90% 苏氨酸 threonine 9.9% 酪氨酸 tyrosine 0.1% 其他： 微量 磷酸化蛋白质检测方法 　 1. 32P or 33P标记和Edman降解 [32 P ]放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测方法。 体内代谢培养用[ 32 P ]标记磷酸盐作为磷酸基团供体,被[ 32 P ]标记的蛋白质进行一维或二维凝胶电泳分离,用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。 磷酸蛋白水解肽段经HPLC分离,通过监测放射性活度收集磷酸肽,用Edman测序或串联质谱分析都可以确定磷酸化位点。 体内或体外标记 非常灵敏、直观地检测磷酸蛋白 2.利用抗磷酸化蛋白的抗体进行Western??blot检测 具有特异性好、 分辨率高 ?至今还是常用的手段 Western Blot原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上。 与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应。 洗涤去除没有结合的特异性抗体。 加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体。 加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。 可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。 操作过程 SDS电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影 荧光检测 小分子的荧光染料Pro-Diamond??dye可对磷酸化蛋白质特异性染色，通过荧光扫描仪检测可以直接显示出一维或二维凝胶电泳胶上分离的磷酸化蛋白质。 荧光强度会随着蛋白质磷酸化程度的不同而呈现出一定的量的变化。 该染料可以与其它检测总蛋白的荧光染料配合使用,同时展示出胶上的总蛋白谱和磷酸化蛋白谱。 这种染料还与质谱兼容,胶上的蛋白质点可以通过胶上酶切进行质谱鉴定。 磷酸蛋白或多肽富集 免疫沉淀或磷酸化抗体亲和层析 强阳离子交换色谱（SCX） 金属螯合色谱（IMAC) 利用金属离子与磷酸肽之间的特异性作用进行分离。 填料的基本构成是:色谱填料-交联剂-金属螯合剂。色谱填料与金属螯合剂亚氨基二乙酸（IDA）交联成为固定相, 金属离子被螯合到固定相上。 磷酸基团与固相化的金属离子通过静电作用吸附,可选择性地亲和提取磷酸肽,在碱性环境下或有磷酸盐存在时,这种相互作用被破坏从而使磷酸肽被洗脱。 金属离子分类及作用对象 Hard metal ion Intermediate metal ion 金属氧化物亲和色谱 化学修饰法 改变磷酸基团的化学性质，然后特异性的分离纯化 具有良好的选择性 可进行定量分析 生物素―亲和素富集 使磷酸基团在碱性条件下发生β消除反应生成双键,再用巯基乙醇通过加成反应取代磷酸基团的位置,最后通过交联剂在巯基上连接生物素,并用亲和素色谱柱分离。 这种方法只适合